KDM4A和GSK126对猪克隆胚胎的体细胞重编程及体外发育潜能影响的研究
发布时间：2023-02-07 12:49
动物克隆技术在加快猪的种质遗传改良、建立人类疾病动物模型和异种器官移植等方面具有巨大优势,这使猪成为生物医学领域的热点模式动物,但是猪克隆的效率非常低下,相关实验材料成熟卵子无法大量获取,而且克隆技术体系掌握不易且仍有待继续完善改进,这极大地限制了猪克隆技术的生产应用。目前,在小鼠上已有报道证实克隆胚胎发育过程中的合子基因组激活(Zygotic Genome Activation,ZGA)异常是导致克隆效率低下的主要原因之一,然而,有关猪克隆胚胎ZGA的情况还不清楚,因此继续深入探究猪克隆胚胎在ZGA时期转录及表观遗传模式的异常,并以此为切入点寻找提高猪克隆效率的有效方法具有十分重要的意义。本研究通过比较猪正常体内受精胚胎和克隆胚胎在转录水平以及表观修饰上的差异,发现组蛋白修饰H3K9me3和H3K27me3大量富集导致了异常的ZGA,本研究提供了一种通过H3K27me3编写酶的抑制剂GSK126和过表达KDM4A提高猪克隆胚胎的体细胞重编程及体外发育潜能的有效策略,有助于进一步推进猪克隆胚胎的临床应用。此外,猪克隆胚胎构建所需的成熟卵子长时间暴露于体外环境下会遭受严重的氧化应激伤害,...
【文章页数】：142 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略语表(Abbreviation)
1 前言
1.1 研究问题由来
1.2 国内外研究现状
1.2.1 动物克隆技术
1.2.2 合子基因组激活(ZGA)
1.2.3 克隆胚胎的表观修饰重编程异常
1.2.4 提高克隆效率的策略
1.3 研究的目的和意义
2 实验材料与方法
2.1 实验材料与仪器设备
2.2 猪卵母细胞体外成熟培养基制备
2.3 猪卵母细胞体外成熟培养
2.3.1 猪卵巢采集
2.3.2 卵丘-卵母细胞复合体（Cumulus-Oocyte-Complex，COC）挑拣及培养
2.3.3 配制Tyrode’s lactate-HEPES-PVA medium(TLH-PVA)
2.4 猪体细胞核移植显微操作针制备
2.4.1 拉针
2.4.2 断针
2.4.3 磨针
2.4.4 洗针
2.4.5 拉尖
2.4.6 打弯
2.5 猪胎儿成纤维细胞(Porcine Fetus Fibroblast,PFF)培养
2.5.1 细胞培养基配制
2.5.2 PFF培养及SCNT前的处理
2.6 猪体细胞核移植
2.6.1 相关培养液配制
2.6.2 挑拣成熟卵
2.6.3 显微操作盘制备
2.6.4 去核——盲吸法
2.6.5 注核
2.6.6 电融合
2.7 孤雌激活
2.8 克隆胚胎mRNA注射
2.8.1 基因克隆
2.8.2 体外转录
2.8.3 克隆胚胎mRNA注射
2.9 卵子早期凋亡检测
2.10 ROS水平检测
2.11 线粒体膜电位水平检测
2.12 谷胱甘肽(GSH)检测
2.13 TUNEL法检测凋亡细胞
2.14 免疫荧光染色
2.15 微量样品总RNA提取
2.16 cDNA第一链合成
2.17 实时定量PCR
2.18 低细胞量RNA-seq
2.19 PFF普通转录组测序
2.20 ULI-Ch IP-seq
2.20.1 所需溶液配方
2.20.2 N-ChIP
2.20.3 KAPA建库
2.21 统计学分析
3 实验结果
3.1 测序样品质量检测
3.2 猪克隆胚胎pre-ZGA时期存在异常的基因转录
3.3 猪4细胞期克隆胚胎重编程抵抗区和记忆保留区的发掘
3.4 阻遏性组蛋白修饰H3K9me3和H3K27me3 是猪克隆胚胎pre-ZGA起始期的重编程障碍
3.5 猪4 细胞期克隆胚胎记忆保留区异常富集组蛋白修饰H3K9me3和H3K27me3
3.6 通过过表达KDM4A来促进猪的体细胞重编程
3.7 过表达KDM4A联合GSK126 处理进一步促进了猪克隆胚胎的发育潜能
3.8 褪黑素缓解卵子老化并促进胚胎发育
3.8.1 确定褪黑素处理体外老化卵子的最佳浓度
3.8.2 褪黑素提高体外老化卵子孤雌胚胎的发育能力
3.8.3 褪黑素缓解体外老化卵子的氧化应激水平
3.8.4 褪黑素降低体外老化卵子的早期凋亡水平
3.8.5 褪黑素延缓体外老化卵子线粒体膜电位降低
3.8.6 褪黑素降低体外老化卵子的自噬水平
4 讨论
4.1 克隆胚胎重编程不完全
4.2 异常组蛋白修饰H3K9me3和H3K27me3 是体细胞重编程的主要障碍
4.3 去除异常组蛋白修饰H3K9me3和H3K27me3 有利于克隆胚胎的体细胞重编程
4.4 技术革新和组合策略提高克隆重编程
4.5 褪黑素维持体外老化卵子质量并提高其胚胎发育潜能
5 小结
5.1 本研究的主要结果与结论
5.2 本研究的创新之处
5.3 本研究的不足之处及建议
参考文献
附录
博士期间发表的论文
致谢
本文编号：3736853
【文章页数】：142 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略语表(Abbreviation)
1 前言
1.1 研究问题由来
1.2 国内外研究现状
1.2.1 动物克隆技术
1.2.2 合子基因组激活(ZGA)
1.2.3 克隆胚胎的表观修饰重编程异常
1.2.4 提高克隆效率的策略
1.3 研究的目的和意义
2 实验材料与方法
2.1 实验材料与仪器设备
2.2 猪卵母细胞体外成熟培养基制备
2.3 猪卵母细胞体外成熟培养
2.3.1 猪卵巢采集
2.3.2 卵丘-卵母细胞复合体（Cumulus-Oocyte-Complex，COC）挑拣及培养
2.3.3 配制Tyrode’s lactate-HEPES-PVA medium(TLH-PVA)
2.4 猪体细胞核移植显微操作针制备
2.4.1 拉针
2.4.2 断针
2.4.3 磨针
2.4.4 洗针
2.4.5 拉尖
2.4.6 打弯
2.5 猪胎儿成纤维细胞(Porcine Fetus Fibroblast,PFF)培养
2.5.1 细胞培养基配制
2.5.2 PFF培养及SCNT前的处理
2.6 猪体细胞核移植
2.6.1 相关培养液配制
2.6.2 挑拣成熟卵
2.6.3 显微操作盘制备
2.6.4 去核——盲吸法
2.6.5 注核
2.6.6 电融合
2.7 孤雌激活
2.8 克隆胚胎mRNA注射
2.8.1 基因克隆
2.8.2 体外转录
2.8.3 克隆胚胎mRNA注射
2.9 卵子早期凋亡检测
2.10 ROS水平检测
2.11 线粒体膜电位水平检测
2.12 谷胱甘肽(GSH)检测
2.13 TUNEL法检测凋亡细胞
2.14 免疫荧光染色
2.15 微量样品总RNA提取
2.16 cDNA第一链合成
2.17 实时定量PCR
2.18 低细胞量RNA-seq
2.19 PFF普通转录组测序
2.20 ULI-Ch IP-seq
2.20.1 所需溶液配方
2.20.2 N-ChIP
2.20.3 KAPA建库
2.21 统计学分析
3 实验结果
3.1 测序样品质量检测
3.2 猪克隆胚胎pre-ZGA时期存在异常的基因转录
3.3 猪4细胞期克隆胚胎重编程抵抗区和记忆保留区的发掘
3.4 阻遏性组蛋白修饰H3K9me3和H3K27me3 是猪克隆胚胎pre-ZGA起始期的重编程障碍
3.5 猪4 细胞期克隆胚胎记忆保留区异常富集组蛋白修饰H3K9me3和H3K27me3
3.6 通过过表达KDM4A来促进猪的体细胞重编程
3.7 过表达KDM4A联合GSK126 处理进一步促进了猪克隆胚胎的发育潜能
3.8 褪黑素缓解卵子老化并促进胚胎发育
3.8.1 确定褪黑素处理体外老化卵子的最佳浓度
3.8.2 褪黑素提高体外老化卵子孤雌胚胎的发育能力
3.8.3 褪黑素缓解体外老化卵子的氧化应激水平
3.8.4 褪黑素降低体外老化卵子的早期凋亡水平
3.8.5 褪黑素延缓体外老化卵子线粒体膜电位降低
3.8.6 褪黑素降低体外老化卵子的自噬水平
4 讨论
4.1 克隆胚胎重编程不完全
4.2 异常组蛋白修饰H3K9me3和H3K27me3 是体细胞重编程的主要障碍
4.3 去除异常组蛋白修饰H3K9me3和H3K27me3 有利于克隆胚胎的体细胞重编程
4.4 技术革新和组合策略提高克隆重编程
4.5 褪黑素维持体外老化卵子质量并提高其胚胎发育潜能
5 小结
5.1 本研究的主要结果与结论
5.2 本研究的创新之处
5.3 本研究的不足之处及建议
参考文献
附录
博士期间发表的论文
致谢
本文编号：3736853
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