鸡卵清蛋白启动子功能分析及验证
发布时间：2023-02-10 15:52
转基因鸡输卵管生物反应器具有高产蛋能力,转基因鸡群快速扩繁能力和与人类相似的蛋白糖基化形式,在药用蛋白生产方面具有不可替代的作用。到目前为止,相继建立了鸡蛋卵白(eggwhite)中表达干扰素、溶菌酶、抗体、促红细胞生成素、表皮生长因子等重组蛋白的转基因鸡。但是对于不同长度卵清蛋白启动子(OVP)活性,以及雌激素应答元件(ERE)和卵清蛋白上游启动子转录因子(COUP-TF)调控作用缺乏系统研究;其次,作为外源基因转移的有效载体,鸡原始生殖细胞(PGCs)分离培养方法也待探讨。本研究的目的是确定鸡OVP核心区域,筛选高转录活性的OVP;探讨ERE和COUP-TF调控作用;摸索鸡PGCs适宜培养方法;通过体外和体内验证试验,确定可望用于制备输卵管生物反应器的OVP。1.CRISPR-d Cas9-VP64介导的鸡卵清蛋白启动子转录活性分析。将启动子cERE-cOVP-2785、cOVP-2785分别亚克隆至p GL3-Basic载体,构建了荧光素酶表达载体p GL3-cERE-cOVP-2785、p GL3-cOVP-2785。利用Lipofectamine?2000将上述2个质粒以及p...
【文章页数】：147 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩写符号说明
第一章 文献综述
1.1 启动子的概念
1.1.1 核心启动子元件(CPE)
1.1.2 上游启动子元件(UPE)
1.2 鸡卵清蛋白
1.2.1 卵清蛋白简介
1.2.2 鸡卵清蛋白的组织特异性与诱导表达
1.2.3 卵清蛋白增强子序列
1.3 鸡卵清蛋白上游启动子转录因子
1.3.1 COUP-TFs作用的分子机制
1.3.2 COUP-TFs的生理功能
1.4 启动子研究分析方法
1.4.1 启动子预测工具
1.4.2 双荧光素酶报告基因检测
1.5 CRISPR-d Cas9 与基因转录后调控
1.5.1 dCas9简介
1.5.2 CRISPR-d Cas9 转录激活或转录抑制效应元件
1.6 鸡原始生殖细胞
1.6.1 鸡胚原始生殖细胞的起源
1.6.2 鸡胚原始生殖细胞超微结构
1.6.3 PGCs的分离
1.6.4 鸡PGCs分离培养相关影响因素
1.6.5 PGCs的生物学特性
1.6.6 PGCs在转基因家禽研究中的应用
1.7 输卵管特异性表达转基因鸡研究
1.7.1 转基因鸡研究方法
1.7.2 输卵管特异性表达转基因鸡研究简史
1.7.3 输卵管特异基因的高通量筛选及其启动子的应用
1.7.4 CRISPR/Cas9介导的输卵管特异性表达转基因鸡研究
1.8 本研究的目的与意义
第二章 CRISPR-d Cas9-VP64 介导的鸡卵清蛋白启动子转录活性分析
2.1 引言
2.2 材料和试剂
2.2.1 主要试剂
2.2.2 主要仪器
2.3 实验方法
2.3.1 含雌激素应答元件的启动子片段(cERE-cOVP-2785)的克隆
2.3.2 重组表达载体p GL3-cERE-cOVP-2785 的构建
2.3.3 重组表达载体p GL3-cOVP-2785 的构建
2.3.4 sgRNA的设计
2.3.5 sgRNA表达载体构建
2.3.6 重组质粒中量抽提
2.3.7 转染
2.4 实验结果
2.4.1 启动子载体构建结果
2.4.2 质粒与转染试剂转染最优比例筛选
2.4.3 不同长度启动子活性的比较
2.4.4 卵清蛋白启动子(cERE-cOVP-2785)不同区域转录活性分析
2.4.5 雌激素对启动子的影响
2.4.6 激活雌激素应答元件不同区域作用结果
2.5 讨论
2.6 小结
第三章 鸡卵清蛋白上游启动子转录因子Ⅰ/Ⅱ功能分析
3.1 引言
3.2 材料和试剂
3.3 实验方法
3.3.1 转录因子重组表达载体构建
3.3.2 去内毒素重组质粒提取
3.3.3 COUP-TFⅠ/Ⅱ调控作用
3.4 实验结果
3.4.1 含转录因子载体构建结果
3.4.2 COUP-TFⅠ与COUP-TFⅡ的调控作用
3.4.3 两个转录因子协同作用分析
3.5 讨论
3.6 小结
第四章 鸡原始生殖细胞的分离及培养
4.1 引言
4.2 材料和试剂
4.2.1 实验材料
4.2.2 主要仪器
4.2.3 主要试剂
4.2.4 有关溶液的配制
4.3 实验方法
4.3.1 饲养层的准备
4.3.2 从5.5日龄的鸡胚(28期)性腺中分离PGCs
4.3.3 从2.5日龄的鸡胚(14期)血液中分离PGCs
4.3.4 鸡PGCs的体外培养体系
4.3.5 PGCs的传代
4.3.6 PGCs的冷冻保存
4.3.7 PGCs的复苏
4.3.8 PGCs的鉴定
4.4 实验结果
4.4.1 两种不同来源PGCs的分离培养
4.4.2 两种不同来源PGCs的克隆形成能力
4.4.3 不同培养体系对鸡PGCs增殖能力的影响
4.4.4 PGCs的冷冻保存
4.4.5 PGCs生物学特性鉴定
4.5 讨论
4.5.1 鸡PGCs的分离培养
4.5.2 鸡PGCs体外长期培养的难点
4.6 小结
第五章 鸡卵清蛋白启动子的功能验证
5.1 引言
5.2 材料与试剂
5.2.1 主要试剂
5.2.2 主要仪器
5.2.3 有关溶液配制
5.3 实验方法
5.3.1 慢病毒的包装
5.3.2 鸡输卵管上皮细胞(OECs)的分离
5.3.3 慢病毒体外感染鸡OECs及 PGCs
5.3.4 体外感染后外源基因表达情况检测
5.3.5 慢病毒体内注射
5.3.6 外源基因表达检测
5.4 实验结果
5.4.1 LaSRT法测定病毒滴度
5.4.2 OECs细胞分离培养
5.4.3 cERE-cOVP-2785 体外功能验证
5.4.4 cERE-cOVP-2785 体内功能验证
5.5 讨论
5.6 小结
全文结论
参考文献
附录
致谢
攻读学位期间发表论文情况
本文编号：3739464
【文章页数】：147 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩写符号说明
第一章 文献综述
1.1 启动子的概念
1.1.1 核心启动子元件(CPE)
1.1.2 上游启动子元件(UPE)
1.2 鸡卵清蛋白
1.2.1 卵清蛋白简介
1.2.2 鸡卵清蛋白的组织特异性与诱导表达
1.2.3 卵清蛋白增强子序列
1.3 鸡卵清蛋白上游启动子转录因子
1.3.1 COUP-TFs作用的分子机制
1.3.2 COUP-TFs的生理功能
1.4 启动子研究分析方法
1.4.1 启动子预测工具
1.4.2 双荧光素酶报告基因检测
1.5 CRISPR-d Cas9 与基因转录后调控
1.5.1 dCas9简介
1.5.2 CRISPR-d Cas9 转录激活或转录抑制效应元件
1.6 鸡原始生殖细胞
1.6.1 鸡胚原始生殖细胞的起源
1.6.2 鸡胚原始生殖细胞超微结构
1.6.3 PGCs的分离
1.6.4 鸡PGCs分离培养相关影响因素
1.6.5 PGCs的生物学特性
1.6.6 PGCs在转基因家禽研究中的应用
1.7 输卵管特异性表达转基因鸡研究
1.7.1 转基因鸡研究方法
1.7.2 输卵管特异性表达转基因鸡研究简史
1.7.3 输卵管特异基因的高通量筛选及其启动子的应用
1.7.4 CRISPR/Cas9介导的输卵管特异性表达转基因鸡研究
1.8 本研究的目的与意义
第二章 CRISPR-d Cas9-VP64 介导的鸡卵清蛋白启动子转录活性分析
2.1 引言
2.2 材料和试剂
2.2.1 主要试剂
2.2.2 主要仪器
2.3 实验方法
2.3.1 含雌激素应答元件的启动子片段(cERE-cOVP-2785)的克隆
2.3.2 重组表达载体p GL3-cERE-cOVP-2785 的构建
2.3.3 重组表达载体p GL3-cOVP-2785 的构建
2.3.4 sgRNA的设计
2.3.5 sgRNA表达载体构建
2.3.6 重组质粒中量抽提
2.3.7 转染
2.4 实验结果
2.4.1 启动子载体构建结果
2.4.2 质粒与转染试剂转染最优比例筛选
2.4.3 不同长度启动子活性的比较
2.4.4 卵清蛋白启动子(cERE-cOVP-2785)不同区域转录活性分析
2.4.5 雌激素对启动子的影响
2.4.6 激活雌激素应答元件不同区域作用结果
2.5 讨论
2.6 小结
第三章 鸡卵清蛋白上游启动子转录因子Ⅰ/Ⅱ功能分析
3.1 引言
3.2 材料和试剂
3.3 实验方法
3.3.1 转录因子重组表达载体构建
3.3.2 去内毒素重组质粒提取
3.3.3 COUP-TFⅠ/Ⅱ调控作用
3.4 实验结果
3.4.1 含转录因子载体构建结果
3.4.2 COUP-TFⅠ与COUP-TFⅡ的调控作用
3.4.3 两个转录因子协同作用分析
3.5 讨论
3.6 小结
第四章 鸡原始生殖细胞的分离及培养
4.1 引言
4.2 材料和试剂
4.2.1 实验材料
4.2.2 主要仪器
4.2.3 主要试剂
4.2.4 有关溶液的配制
4.3 实验方法
4.3.1 饲养层的准备
4.3.2 从5.5日龄的鸡胚(28期)性腺中分离PGCs
4.3.3 从2.5日龄的鸡胚(14期)血液中分离PGCs
4.3.4 鸡PGCs的体外培养体系
4.3.5 PGCs的传代
4.3.6 PGCs的冷冻保存
4.3.7 PGCs的复苏
4.3.8 PGCs的鉴定
4.4 实验结果
4.4.1 两种不同来源PGCs的分离培养
4.4.2 两种不同来源PGCs的克隆形成能力
4.4.3 不同培养体系对鸡PGCs增殖能力的影响
4.4.4 PGCs的冷冻保存
4.4.5 PGCs生物学特性鉴定
4.5 讨论
4.5.1 鸡PGCs的分离培养
4.5.2 鸡PGCs体外长期培养的难点
4.6 小结
第五章 鸡卵清蛋白启动子的功能验证
5.1 引言
5.2 材料与试剂
5.2.1 主要试剂
5.2.2 主要仪器
5.2.3 有关溶液配制
5.3 实验方法
5.3.1 慢病毒的包装
5.3.2 鸡输卵管上皮细胞(OECs)的分离
5.3.3 慢病毒体外感染鸡OECs及 PGCs
5.3.4 体外感染后外源基因表达情况检测
5.3.5 慢病毒体内注射
5.3.6 外源基因表达检测
5.4 实验结果
5.4.1 LaSRT法测定病毒滴度
5.4.2 OECs细胞分离培养
5.4.3 cERE-cOVP-2785 体外功能验证
5.4.4 cERE-cOVP-2785 体内功能验证
5.5 讨论
5.6 小结
全文结论
参考文献
附录
致谢
攻读学位期间发表论文情况
本文编号：3739464
本文链接：https://www.wllwen.com/shoufeilunwen/nykjbs/3739464.html