Gh4CL30和GhWRKY70D13在棉花抗黄萎病中的功能研究

发布时间：2023-04-16 07:39

　　目的:棉花(Gossypium hirsutum L.)是世界上重要的经济作物和天然纤维的主要来源,在国民经济中占有重要地位。棉花在生长过程中经常会受到各种生物和非生物的胁迫导致棉花减产,如冷害、干旱和病虫害等。由大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)引起的棉花黄萎病(Cotton Verticillium Wilt)是影响世界棉花生产最为严重的病害,被称为棉花的“癌症”。提高棉花品种对黄萎病菌抗性是防治黄萎病最经济和最有效的方法。由于陆地棉缺乏黄萎病抗源,常规育种手段很难解决其抗病难题。因此,开展棉花抗黄萎病分子机制研究,对利用基因工程手段提高陆地棉对黄萎病抗性具有重要意义。方法:(1)本研究利用转录组测序(RNA-seq)技术,对陆地棉中抗黄萎病品种石大陆抗-1(SD)和感黄萎病品种军棉1号(JM)之间差异表达基因进行挖掘,并对其中受黄萎病菌诱导表达的基因所涉及的相关通路进行了注释,利用加权基因共表达网络分析(WGCNA)筛选抗病候选基因。(2)分析了SD和JM接种黄萎病菌后不同时间点的差异表达基因,利用Blast2GO和KOBAS 2.0软件分别对黄萎病菌诱导的差...

【文章页数】：132 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
Abstract
英文缩略表
引言
第一章 文献综述
    1.1 植物抗病机制研究进展
    1.2 棉花黄萎病及其防治
        1.2.1 棉花黄萎病及其危害
        1.2.2 棉花黄萎病菌的侵染过程和致病机理
        1.2.3 棉花黄萎病防治技术
    1.3 棉花黄萎病抗性机制研究
        1.3.1 次生代谢产物在棉花与黄萎病菌互作中的作用
        1.3.2 植物激素在棉花与黄萎病菌互作中的作用
第二章 棉花黄萎病菌胁迫后的转录组学研究
    2.1 材料
        2.1.1 植物材料、菌株
        2.1.2 实验试剂
    2.2 实验方法
        2.2.1 棉花材料的准备
        2.2.2 黄萎病病原菌的活化、培养和接种
        2.2.3 棉花材料抗病性鉴定
        2.2.4 黄萎病菌恢复培养和真菌相对含量检测
        2.2.5 棉花总RNA的提取和质量检测
        2.2.6 cDNA文库构建及转录组测序
        2.2.7 数据质量评估与差异表达基因筛选
        2.2.8 差异表达基因GO和 KEGG富集分析
        2.2.9 加权基因共表达网络分析(WGCNA)
        2.2.10 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)验证转录组测序结果
    2.3 结果分析
        2.3.1 陆地棉品种SD和 JM抗病性鉴定
        2.3.2 测序数据质量评估及可靠性验证
        2.3.3 接种黄萎病菌前SD和 JM之间差异表达基因挖掘
        2.3.4 SD和 JM之间差异基因WGCNA分析
        2.3.5 SD和 JM之间的差异基因参与棉花响应黄萎病菌侵染
        2.3.6 SD和 JM接种黄萎病菌后差异基因筛选
        2.3.7 SD和 JM接种黄萎病菌后差异基因GO和 KEGG富集分析
        2.3.8 木质素合成相关基因参与棉花响应黄萎病菌侵染
        2.3.9 激素与棉花抗病反应
    2.4 讨论
        2.4.1 棉花响应黄萎病菌侵染转录组学研究
        2.4.2 木质素参与棉花抗黄萎病反应
        2.4.3 植物激素参与棉花抗黄萎病反应
第三章 Gh4CL30 在棉花抗黄萎病中的功能验证
    3.1 实验材料
        3.1.1 植物材料、菌株及载体
        3.1.2 实验试剂
    3.2 实验方法
        3.2.1 棉花材料的准备
        3.2.2 棉花黄萎病菌的活化、培养和接种
        3.2.3 RNA提取、反转录以及qRT-PCR分析
        3.2.4 病毒诱导的基因沉默(VIGS)
        3.2.5 棉花接种黄萎病菌后发病率及病情指数统计
        3.2.6 黄萎病菌恢复培养和真菌相对含量检测
        3.2.7 木质素组织化学染色
        3.2.8 棉花总木质素和木质素单体含量测定
        3.2.9 棉花内源SA和 JA含量测定
        3.2.10 棉花总黄酮含量测定
        3.2.11 棉花茎秆甲醇提取物的抑菌性鉴定
        3.2.12 HPLC-MS/MS法测量棉花咖啡酸、阿魏酸、肉桂酸和香豆酸含量
        3.2.13 咖啡酸和阿魏酸抑菌性测定
    3.3 结果分析
        3.3.1 Gh4CL30 组织表达与黄萎病菌诱导表达模式分析
        3.3.2 沉默Gh4CL30 对棉花黄萎病抗性的影响
        3.3.3 Gh4CL30 沉默植株中木质素含量变化
        3.3.4 Gh4CL30 沉默植株中木质素单体含量变化
        3.3.5 沉默Gh4CL30对SA和 JA信号通路的影响
        3.3.6 Gh4CL30 沉默对黄酮的生物合成的影响
        3.3.7 Gh4CL30 沉默植株茎秆中出现红棕色物质积累
        3.3.8 Gh4CL30 沉默植株抗病性增强与咖啡酸和阿魏酸的关系
    3.4 讨论
        3.4.1 沉默Gh4CL30 改变木质素的生物合成
        3.4.2 Gh4CL30 沉默抑制SA和 JA信号通路和黄酮生物合成
        3.4.3 咖啡酸和阿魏酸的积累有助于提高Gh4CL30 沉默植株抗病性
第四章 GhWRKY70D13 在棉花抗黄萎病中的功能分析
    4.1 材料
        4.1.1 植物材料、菌株及载体
        4.1.2 实验试剂
    4.2 实验方法
        4.2.1 棉花GhWRKY70 家族基因的查找和生物信息学分析
        4.2.2 棉花GhWRKY70 家族基因启动子顺式作用原件分析
        4.2.3 棉花材料的准备
        4.2.4 黄萎病病原菌菌的活化、培养和接种
        4.2.5 水杨酸、茉莉酸甲酯和乙烯利处理棉花
        4.2.6 RNA提取、反转录以及qRT-PCR分析
        4.2.7 病毒诱导的基因沉默(VIGS)
        4.2.8 棉花接种黄萎病菌后发病率及病情指数统计
        4.2.9 黄萎病菌恢复培养和真菌相对含量检测
        4.2.10 GhWRKY70A05a、GhWRKY70A06及Gh WRKY70D13 基因的克隆
        4.2.11 GhWRKY70D13 基因干扰表达载体构建及棉花遗传转化
        4.2.12 黄萎病菌处理后GhWRKY70D13 干扰材料的转录组分析
        4.2.13 差异表达基因KEGG富集分析
        4.2.14 HPLC-MS/MS法测量棉花内源1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)、SA和 JA含量
    4.3 结果分析
        4.3.1 陆地棉GhWRKY70 家族基因的全基因鉴定
        4.3.2 陆地棉GhWRKY70 家族基因结构域和进化分析
        4.3.3 陆地棉GhWRKY70 家族基因启动子顺式作用原件分析
        4.3.4 陆地棉GhWRKY70 家族基因的组织表达模式分析
        4.3.5 陆地棉GhWRKY70 家族基因在不同激素处理表达模式分析
        4.3.6 陆地棉GhWRKY70 家族在黄萎病菌接种后表达模式分析
        4.3.7 TRV:GhWRKY70D13 干涉植株提高棉花对黄萎病的抗性
        4.3.8 GhWRKY70D13-RNAi转基因棉花抗病性鉴定
        4.3.9 抑制表达GhWRKY70D13 后的转录组分析
        4.3.10 抑制GhWRKY70D13 表达激活ET信号通路
        4.3.11 抑制GhWRKY70D13 表达对JA信号通路的影响
        4.3.12 抑制GhWRKY70D13 表达降低SA的生物合成
    4.4 讨论
第五章 全文结论、创新点与展望
    5.1 全文结论
    5.2 全文创新点
    5.3 展望
参考文献
附录
致谢
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本文编号：3791142