团头鲂肌间刺发育相关基因的发掘与功能研究
发布时间：2023-04-22 00:47
鱼类的肌间刺(intermuscular bones,IB),又称肌间骨,是由肌肉中肌隔结缔组织连续同源骨化而来的膜骨,特异性的存在于肌隔中。世界上大部分淡水养殖鱼类,尤其是鲤科鱼类,都有一定数量的肌间刺。肌间刺的存在严重影响了鱼产品的食用与深加工,从而导致有肌间刺的鱼类不受消费者青睐。同时,含有肌间刺的鱼类不易出口,市场价格低,极大的影响了其经济价值。国内外对鱼类肌间刺的研究多处于形态发育方面,对于肌间刺发生发育分子机制的研究还非常缺乏。为进一步探究鱼类肌间刺的发生发育机制,本研究以我国特色经济养殖鱼类团头鲂(Megahbrama amblycephala Yih),俗称武昌鱼,为研究对象。首先对团头鲂肌间刺及其相关组织的显微结构进行了观察,依托其组织差异以及潜在分化关系分别进行了m RNA与mi RNA的比较组学分析;基于肌间刺骨化出现的四个关键时期信息,进行了m RNA与非编码mi RNA的表达模式关联分析,发掘了大量与肌间刺发育相关的遗传信息。此外,考虑到幼年团头鲂(6月龄)与成年团头鲂(3龄)肌间刺形态特征的显著差异,我们构建了肌间刺组织的三代全长转录组数据库,补充了团头鲂基...
【文章页数】：153 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略语表
第一章 文献综述
1 鱼类肌间刺研究进展
1.1 鱼类肌间刺形态发育学研究
1.2 鱼类肌间刺选育可行性分析与遗传学研究
2 动物骨骼发育相关信号通路与基因的研究进展
2.1 哺乳动物骨骼发育相关信号通路
2.2 哺乳动物骨骼发育相关基因
2.3 鱼类骨骼发育相关信号通路与基因
3 动物骨骼发育相关非编码RNA的研究进展
3.1 动物非编码RNA的分子功能与作用机制
3.2 ncRNA对哺乳动物骨骼发育的调控
3.3 ncRNA对鱼类骨骼发育的调控
4 高通量测序技术的发展及其在鱼类中的应用
4.1 高通量测序技术
4.2 高通量测序技术在鱼类研究中的应用
5 团头鲂肌间刺研究的目的和意义
第二章 团头鲂肌间刺,肌隔结缔组织与肌肉组织的显微结构观察及转录组分析
1 前言
2 材料和方法
2.1 实验材料
2.2 实验方法
2.2.1 形态学观察
2.2.2 Total RNA提取
2.2.3 cDNA文库构建及高通量测序
2.2.4 原始数据质控、装配及数据库比对
2.2.5 Unigenes与 miRNA的差异表达分析
2.2.6 差异表达Unigenes与 miRNA靶基因的功能注释
2.2.7 Unigenes与 miRNA的表达模式验证
3 结果与分析
3.1 三种组织的切片及染色观察结果
3.2 三种组织的转录组数据分析
3.2.1 转录组数据装配
3.2.2 数据库比对
3.3 肌间刺与肌隔结缔组织的sRNA转录组数据分析
3.3.1 序列比对与分类注释
3.3.2 团头鲂miRNA鉴定
3.3.3 团头鲂miRNA异构体现象(isomiRs)
3.4 unigene差异表达分析
3.4.1 三种组织间差异表达unigenes的发掘
3.4.2 三种组织间差异表达unigenes的功能注释
3.4.3 三种组织特异性表达unigenes的发掘与功能注释
3.5 miRNA差异表达分析
3.5.1 肌间刺与肌隔结缔组织间差异表达miRNA的发掘
3.5.2 肌间刺与肌隔结缔组织间差异表达miRNA靶基因预测及功能注释
3.6 Unigenes与 miRNAs的表达模式验证
4 讨论
第三章 肌间刺关键发育时期m RNA与 miRNA表达模式的关联分析与验证
1 前言
2 材料和方法
2.1 实验动物和组织取样
2.2 Total RNA提取及cDNA文库构建
2.3 参考转录组装配及功能注释
2.4 不同发育时期基因表达谱分析
2.5 Mi RNA表达模式及 mRNA-miRNA互作分析
2.6 miRNA与 m RNA的表达验证
2.7 miRNAs与靶基因的调控关系验证
2.7.1 双荧光素酶报告载体构建
2.7.2 miRNAs mimics的合成
2.7.3 细胞转染
2.7.4 双荧光素酶活性检测
3 结果和分析
3.1 参考转录组的装配与注释
3.2 肌间刺不同发育时期的基因表达模式
3.3 不同发育时期miRNA表达模式分析
3.4 miRNA-m RNA互作关系分析
3.5 miRNA和 m RNA的表达模式验证
3.6 miR-133b-3p与 miR-206-3p的靶基因验证
4 讨论
第四章 团头鲂肌间刺三代全长转录组构建
1 前言
2 材料和方法
2.1 实验材料
2.2 实验方法
2.2.1 Total RNA提取
2.2.2 Pac Bio Iso-Seq库的构建和测序
2.2.3 Iso-Seq下机数据处理,校正及参考基因组比对
2.2.4 基因结构分析
2.2.5 LncRNA分析
2.2.6 基因isoforms的验证
3 结果与分析
3.1 原始数据处理及全长转录本分析
3.2 参考基因组比对分析
3.3 基因结构分析
3.3.1 全长转录本分类及特征分析
3.3.2 可变剪接,多聚腺苷酸化及转录因子分析
3.3.3 ORF预测与融合基因分析
3.4 LncRNA分析
3.5 Unmapped转录本和新基因转录本的功能注释
3.6 基因isoforms的验证
4 讨论
第五章 肌间刺不同生长阶段lnc RNA与 miRNA的表达模式分析
1 前言
2 材料和方法
2.1 实验组织及total RNA提取
2.2 文库构建及测序
2.3 原始数据质控与序列比对
2.4 LncRNA与 miRNA的鉴定与特征分析
2.5 lnc RNA与 miRNA的差异表达分析
2.6 lnc RNA与 miRNA的靶基因预测与功能注释
2.7 lnc RNA,miRNA与 m RNA的 ce RNA网络调控
3 结果和分析
3.1 LncRNA和 miRNA转录组数据过滤与比对
3.2 LncRNA和 miRNA的筛选与特征分析
3.3 LncRNA和 miRNA的差异表达分析
3.4 LncRNA与 miRNA的靶基因预测及功能注释
3.5 lnc RNA-miRNA-m RNA的 ce RNA网络
3.6 lnc RNA与 miRNA的表达验证
4 讨论
第六章 BMPII型受体基因在斑马鱼骨骼发育中的功能验证
1 前言
2 材料和方法
2.1 系统发育分析和基因组结构分析
2.2 实验鱼,gRNA设计,突变体构建
2.3 突变体斑马鱼的表型观察
2.4 比较转录组分析
2.5 BMP-Smad通路基因和骨骼发育相关基因的定量表达分析
2.6 Western blot蛋白表达分析
3 结果和分析
3.1 染色体同线分析与bmpr2基因保守性分析
3.2 bmpr2a和 bmpr2b突变体斑马鱼的获得
3.3 bmpr2a-/-与bmpr2b-/-斑马鱼肌间刺发育正常
3.4 bmpr2b-/-表现出不同程度的矿化骨畸形
3.5 Bmpr2b功能丧失导致BMP-Smad信号分子及骨骼发育相关基因表达量发生显著变化
4 讨论
小结
主要研究结果
研究创新点
参考文献
附录一 附加文件详细信息
附表1 miRNA反转录特异性茎环引物
附表2 miRNAs荧光定量引物
附表3 miRNA反转录茎环引物
附表4 miRNAs荧光定量引物
附表5 基因isoforms验证引物
附表6 lnc RNA-miRNA-m RNA的 ce RNA网络(显示部分结果)
附件7 矿化骨与软骨染色方法
附件8 bmpr2a突变体斑马鱼序列信息
附件9 bmpr2b突变体斑马鱼序列信息
附录二 攻读博士学位期间发表论文和授权专利
附录三 攻读博士学位期间所获得奖励与荣誉
致谢
本文编号：3796580
【文章页数】：153 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略语表
第一章 文献综述
1 鱼类肌间刺研究进展
1.1 鱼类肌间刺形态发育学研究
1.2 鱼类肌间刺选育可行性分析与遗传学研究
2 动物骨骼发育相关信号通路与基因的研究进展
2.1 哺乳动物骨骼发育相关信号通路
2.2 哺乳动物骨骼发育相关基因
2.3 鱼类骨骼发育相关信号通路与基因
3 动物骨骼发育相关非编码RNA的研究进展
3.1 动物非编码RNA的分子功能与作用机制
3.2 ncRNA对哺乳动物骨骼发育的调控
3.3 ncRNA对鱼类骨骼发育的调控
4 高通量测序技术的发展及其在鱼类中的应用
4.1 高通量测序技术
4.2 高通量测序技术在鱼类研究中的应用
5 团头鲂肌间刺研究的目的和意义
第二章 团头鲂肌间刺,肌隔结缔组织与肌肉组织的显微结构观察及转录组分析
1 前言
2 材料和方法
2.1 实验材料
2.2 实验方法
2.2.1 形态学观察
2.2.2 Total RNA提取
2.2.3 cDNA文库构建及高通量测序
2.2.4 原始数据质控、装配及数据库比对
2.2.5 Unigenes与 miRNA的差异表达分析
2.2.6 差异表达Unigenes与 miRNA靶基因的功能注释
2.2.7 Unigenes与 miRNA的表达模式验证
3 结果与分析
3.1 三种组织的切片及染色观察结果
3.2 三种组织的转录组数据分析
3.2.1 转录组数据装配
3.2.2 数据库比对
3.3 肌间刺与肌隔结缔组织的sRNA转录组数据分析
3.3.1 序列比对与分类注释
3.3.2 团头鲂miRNA鉴定
3.3.3 团头鲂miRNA异构体现象(isomiRs)
3.4 unigene差异表达分析
3.4.1 三种组织间差异表达unigenes的发掘
3.4.2 三种组织间差异表达unigenes的功能注释
3.4.3 三种组织特异性表达unigenes的发掘与功能注释
3.5 miRNA差异表达分析
3.5.1 肌间刺与肌隔结缔组织间差异表达miRNA的发掘
3.5.2 肌间刺与肌隔结缔组织间差异表达miRNA靶基因预测及功能注释
3.6 Unigenes与 miRNAs的表达模式验证
4 讨论
第三章 肌间刺关键发育时期m RNA与 miRNA表达模式的关联分析与验证
1 前言
2 材料和方法
2.1 实验动物和组织取样
2.2 Total RNA提取及cDNA文库构建
2.3 参考转录组装配及功能注释
2.4 不同发育时期基因表达谱分析
2.5 Mi RNA表达模式及 mRNA-miRNA互作分析
2.6 miRNA与 m RNA的表达验证
2.7 miRNAs与靶基因的调控关系验证
2.7.1 双荧光素酶报告载体构建
2.7.2 miRNAs mimics的合成
2.7.3 细胞转染
2.7.4 双荧光素酶活性检测
3 结果和分析
3.1 参考转录组的装配与注释
3.2 肌间刺不同发育时期的基因表达模式
3.3 不同发育时期miRNA表达模式分析
3.4 miRNA-m RNA互作关系分析
3.5 miRNA和 m RNA的表达模式验证
3.6 miR-133b-3p与 miR-206-3p的靶基因验证
4 讨论
第四章 团头鲂肌间刺三代全长转录组构建
1 前言
2 材料和方法
2.1 实验材料
2.2 实验方法
2.2.1 Total RNA提取
2.2.2 Pac Bio Iso-Seq库的构建和测序
2.2.3 Iso-Seq下机数据处理,校正及参考基因组比对
2.2.4 基因结构分析
2.2.5 LncRNA分析
2.2.6 基因isoforms的验证
3 结果与分析
3.1 原始数据处理及全长转录本分析
3.2 参考基因组比对分析
3.3 基因结构分析
3.3.1 全长转录本分类及特征分析
3.3.2 可变剪接,多聚腺苷酸化及转录因子分析
3.3.3 ORF预测与融合基因分析
3.4 LncRNA分析
3.5 Unmapped转录本和新基因转录本的功能注释
3.6 基因isoforms的验证
4 讨论
第五章 肌间刺不同生长阶段lnc RNA与 miRNA的表达模式分析
1 前言
2 材料和方法
2.1 实验组织及total RNA提取
2.2 文库构建及测序
2.3 原始数据质控与序列比对
2.4 LncRNA与 miRNA的鉴定与特征分析
2.5 lnc RNA与 miRNA的差异表达分析
2.6 lnc RNA与 miRNA的靶基因预测与功能注释
2.7 lnc RNA,miRNA与 m RNA的 ce RNA网络调控
3 结果和分析
3.1 LncRNA和 miRNA转录组数据过滤与比对
3.2 LncRNA和 miRNA的筛选与特征分析
3.3 LncRNA和 miRNA的差异表达分析
3.4 LncRNA与 miRNA的靶基因预测及功能注释
3.5 lnc RNA-miRNA-m RNA的 ce RNA网络
3.6 lnc RNA与 miRNA的表达验证
4 讨论
第六章 BMPII型受体基因在斑马鱼骨骼发育中的功能验证
1 前言
2 材料和方法
2.1 系统发育分析和基因组结构分析
2.2 实验鱼,gRNA设计,突变体构建
2.3 突变体斑马鱼的表型观察
2.4 比较转录组分析
2.5 BMP-Smad通路基因和骨骼发育相关基因的定量表达分析
2.6 Western blot蛋白表达分析
3 结果和分析
3.1 染色体同线分析与bmpr2基因保守性分析
3.2 bmpr2a和 bmpr2b突变体斑马鱼的获得
3.3 bmpr2a-/-与bmpr2b-/-斑马鱼肌间刺发育正常
3.4 bmpr2b-/-表现出不同程度的矿化骨畸形
3.5 Bmpr2b功能丧失导致BMP-Smad信号分子及骨骼发育相关基因表达量发生显著变化
4 讨论
小结
主要研究结果
研究创新点
参考文献
附录一 附加文件详细信息
附表1 miRNA反转录特异性茎环引物
附表2 miRNAs荧光定量引物
附表3 miRNA反转录茎环引物
附表4 miRNAs荧光定量引物
附表5 基因isoforms验证引物
附表6 lnc RNA-miRNA-m RNA的 ce RNA网络(显示部分结果)
附件7 矿化骨与软骨染色方法
附件8 bmpr2a突变体斑马鱼序列信息
附件9 bmpr2b突变体斑马鱼序列信息
附录二 攻读博士学位期间发表论文和授权专利
附录三 攻读博士学位期间所获得奖励与荣誉
致谢
本文编号：3796580
本文链接：https://www.wllwen.com/shoufeilunwen/nykjbs/3796580.html