羧酸酯酶基因MdαE7介导的家蝇对马拉硫磷的抗性

发布时间：2023-04-22 22:25

　　家蝇(Musca domestica L.)属于双翅目、环裂亚目、蝇科、家蝇属。作为一种重要的病媒生物,能够传播多种疾病,如痢疾、霍乱、沙眼等,严重威胁人畜健康。目前,化学防治仍是治理家蝇最有效的方法,由于其分布范围广、繁殖速度快、适应能力强,随着杀虫药剂的广泛大量使用,家蝇已对多种卫生害虫常用杀虫剂产生抗性。前期生物测定发现,在实验室反选获得的家蝇马拉硫磷敏感品系中,雄蝇抗性显著高于雌蝇。本文以实验室的家蝇马拉硫磷敏感品系和抗性近等位基因系为研究对象,结合遗传杂交,利用生物测定、生化、分子生物学及计算机模拟技术,对羧酸酯酶介导的家蝇马拉硫磷抗性进行了系统研究,旨在阐明家蝇对马拉硫磷产生性别抗性差异的机制,为制定合理有效的害虫防治策略提供理论基础。增效剂试验表明,与敏感品系雌蝇相比,DEF对敏感品系雄蝇和抗性雌雄蝇的增效作用明显,增效比均达到100倍以上,初步推断酯酶参与家蝇马拉硫磷抗性及性别抗性差异的形成。通过克隆家蝇羧酸酯酶基因MdαE7的ORF全长和序列比对,发现与敏感种群相比,抗性种群中共存在7个稳定的突变位点:Ser250-Thr、Trp251-Ser、Met303-He、L...

【文章页数】：95 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
abstract
第一章 文献综述
    1.1 有机磷类杀虫药剂概述
        1.1.1 有机磷类杀虫药剂发展小史
        1.1.2 有机磷类杀虫药剂的作用机制
        1.1.3 家蝇对有机磷类杀虫药剂的抗性现状
    1.2 羧酸酯酶介导的昆虫抗药性机制
        1.2.1 羧酸酯酶概述
        1.2.2 羧酸酯酶与昆虫抗药性关系
    1.3 家蝇性别与抗药性关系
        1.3.1 家蝇性别决定机制
        1.3.2 家蝇性别调控方式
        1.3.3 家蝇性别抗性差异研究
    1.4 杆状病毒表达系统
        1.4.1 杆状病毒
        1.4.2 杆状病毒表达载体
    1.5 本文研究的目的的和意义
第二章 DEF对家蝇马拉硫磷抗性的影响
    2.1 材料与方法
        2.1.1 供试虫源
        2.1.2 主要试剂
        2.1.3 生物测定
        2.1.4 增效剂试验
    2.2 结果于分析
        2.2.1 家蝇马拉硫磷敏感和抗性品系的抗性水平
        2.2.2 增效剂试验结果
    2.3 讨论
第三章 家蝇羧酸酯酶基因MdαE7的克隆及分析
    3.1 材料与方法
        3.1.1 供试虫源
        3.1.2 主要试剂及材料
        3.1.3 相关试剂配制
        3.1.4 主要仪器
        3.1.5 Total RNA提取及cDNA第一条链的合成
        3.1.6 PCR扩增、回收、连接和转化
        3.1.7 阳性克隆鉴定
        3.1.8 酯酶三维建模
    3.2 结果与分析
        3.2.1 RNA的提取
        3.2.2 序列分析
        3.2.3 三维结构分析
    3.3 讨论
第四章 羧酸酯酶基因MdαE7突变与马拉硫磷抗性相关性及性别连锁分析
    4.1 材料与方法
        4.1.1 供试虫源
        4.1.2 主要试剂
        4.1.3 主要仪器
        4.1.4 遗传杂交
        4.1.5 马拉硫磷药剂处理
        4.1.6 单头家蝇Total RNA提取及cDNA第一条链的合成
        4.1.7 PCR扩增及测序
    4.2 结果与分析
        4.2.1 不同遗传世代家蝇对马拉硫磷的抗性水平
        4.2.2 MdαE7基因各突变位点频率与马拉硫磷抗性的关系
        4.2.3 MdαE7基因与雄性决定因子(M因子)连锁分析
    4.3 讨论
第五章 家蝇羧酸酯酶MdαE7外源表达
    5.1 材料与方法
        5.1.1 供试虫源
        5.1.2 主要试剂
        5.1.3 主要仪器
        5.1.4 羧酸酯酶表达载体构建
        5.1.5 定点突变
        5.1.6 细胞培养
        5.1.7 重组病毒载体构建及细胞转染
        5.1.8 P2代重组病毒液扩增及滴度测定
        5.1.9 羧酸酯酶外源表达及表达产物制备
        5.1.10 羧酸酯酶外源表达验证
    5.2 结果与分析
        5.2.1 羧酸酯酶表达载体验证
        5.2.2 重组病毒载体鉴定
        5.2.3 P2代重组病毒滴度
        5.2.4 羧酸酯酶表达产物电泳图谱
    5.3 讨论
第六章 家蝇羧酸酯酶MdαE7及其突变体的功能分析
    6.1 材料与方法
        6.1.1 主要试剂
        6.1.2 主要仪器
        6.1.3 细胞毒性试验
        6.1.4 羧酸酷酶模式底物的水解活性测定
        6.1.5 马拉硫磷的代谢活性测定
        6.1.6 羧酸酯酶与模式底物和马拉硫磷的分子对接分析
    6.2 结果与分析
        6.2.1 马拉硫磷对细胞毒性试验结果
        6.2.2 羧酸酯酶表达产物对模式底物的水解活性
        6.2.3 羧酸酯酶表达产物对马拉硫磷的代谢活性
        6.2.4 羧酸酯酶与模式底物和马拉硫磷的分子对接结果
    6.3 讨论
第七章 家蝇羧酸酯酶基因MdαE7表达水平研究
    7.1 材料与方法
        7.1.1 供试虫源
        7.1.2 主要试剂及材料
        7.1.3 主要仪器
        7.1.4 基因组提取
        7.1.5 Total RNA提取及cDNA第一条链的合成
        7.1.6 标准曲线制作
        7.1.7 荧光定量PCR反应
    7.2 结果与分析
        7.2.1 标准曲线生成
        7.2.2 家蝇羧酸酯酶基因MdαE7的DNA和mRNA表达量分析
    7.3 讨论
全文总结
    1. 研究总结
    2. 创新点
    3. 问题与展望
参考文献
致谢
作者简介



本文编号：3798515