橡胶树胶孢炭疽菌效应蛋白CgCP1基因的克隆和功能分析
发布时间：2023-04-27 04:24
由胶孢炭疽菌引起的炭疽病害是造成海南省橡胶树减产的主要原因之一。目前,关于橡胶树胶孢炭疽菌的致病机制的研究还十分有限。效应蛋白是病原真菌的主要致病因子之一。通过生物信息学分析,我们预测到了一个编码候选效应蛋白的基因,将其命名为CgCP1,并对其进行了鉴定和功能研究,主要结果如下:1、通过RT-PCR技术克隆了该基因的编码区序列,测序结果表明编码区序列含有一个678bp的开放阅读框(ORF),编码226个氨基酸的肽链。生物信息学分析结果显示,CgCPl蛋白是Cerato-platanin蛋白家族的一个分支,含有一个N末端信号肽序列(1-19aa),一个Cerato-platanin蛋白家族特有的Cerato-platanin保守结构域(36-132aa)和一个 C端保守的 13 肽基序(apopolysialoglycoprotein,ApoPSGP)。2、通过同源重组技术构建了橡胶树胶孢炭疽菌CgCP1基因的敲除突变株ΔCgCP1 及互补株 Res-ACgCP1。3、通过对野生型菌株WT、ΔCgCP1和Res-ACgCP1的生长情况和孢子产量进行分析,发现WT、ΔCgCP1和Res-A...
【文章页数】：82 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
1 前言
1.1 橡胶树及其病害
1.2 橡胶树炭疽病及其病原
1.3 真菌的致病机制
1.3.1 效应蛋白在真菌致病机制中的作用
1.3.2 黑色素在真菌致病机制中的作用
1.3.3 活性氧在真菌致病机制中的作用
1.4 Cerato-platanin效应蛋白
1.5 本研究的目的意义
1.6 技术路线
2 材料与方法
2.1 植物材料、菌株、质粒、试剂
2.2 实验仪器
2.3 橡胶树胶孢炭疽菌CgCP1基因生物信息学分析
2.4 橡胶树炭疽病菌基因组DNA和总RNA的提取
2.4.1 橡胶树胶孢炭疽菌的DNA提取
2.4.2 橡胶树胶孢炭疽菌的总RNA提取
2.5 橡胶树炭疽菌CgCP1基因的克隆
2.6 载体的构建
2.6.1 敲除载体的构建
2.6.2 CgCP1互补载体的构建
2.6.3 原生质体瞬时表达载体(pUC19-35S::CgCP1-FLAG)的构建
2.6.4 原生质体亚细胞定位载体(pUC19-35s::CgCP1-GFP)的构建
2.6.5 植物表达载体(pEGAD-35s::CgCP1-GFP)的构建
2.6.6 植物表达载体提取质粒
2.7 橡胶树胶孢炭疽菌原生质体的制备和转化
2.8 胶孢炭疽菌突变株的鉴定
2.9 突变株的表型分析
2.10 半定量检测CgCP1基因表达量
2.11 突变株机械穿透力实验
2.12 突变株致病性分析
2.13 炭疽菌侵染橡胶树叶片活性氧检测
2.14 黑色素含量测定
2.15 黑色素合成酶表达量分析
2.16 CgCP1基因中的磷酸化位点点突变
2.16.1 扩增磷酸化位点突变的CgCP1基因
2.16.2 CgCP1磷酸化位点突变互补载体的构建
2.16.3 磷酸化位点突变株的鉴定
2.16.4 磷酸化位点突变株表型分析
2.17 植物表达载体转化农杆菌感受态细胞
2.18 农杆菌注射烟草瞬时表达CgCP1
2.19 烟草细胞坏死检测
2.20 橡胶树叶片原生质体制备
2.21 橡胶树原生质体总蛋白的提取
2.22 western blot检测CgCP1蛋白表达
2.23 橡胶树原生质体活性氧检测
2.24 CgCP1在橡胶树原生质体中的亚细胞定位
3 结果与分析
3.1 胶孢炭疽菌Cerato-platanin蛋白基因CgCP1的生物信息学分析
3.2 CgCP1敲除突变体菌株和互补菌株的鉴定
3.3 CgCP1基因对生长速率及产孢能力的影响
3.4 CgCP1基因对黑色素合成的影响
3.5 CgCP1蛋白的磷酸化对其功能的影响
3.6 CgCP1影响胶孢炭疽菌对橡胶树的致病力
3.7 CgCP1对胶孢炭疽菌菌丝机械穿透力的影响
3.8 CgCP1对植物先天免疫反应的影响
3.8.1 CgCP1诱导橡胶树叶片活性氧的产生
3.8.2 CgCP1对橡胶树防卫反应基因HbPR1、HbPR5表达的影响
3.8.3 CgCPl诱导烟草叶片坏死
3.9 CgCP1在橡胶树中的亚细胞定位
4 讨论
5 结论
参考文献
附录
附录Ⅰ 引物序列表
附录Ⅱ 原生质体制备过程中各种试剂
附录Ⅲ 本实验所用仪器及器材
附录Ⅳ 培养基及其他试剂配方
附录Ⅴ 凝胶片段回收
附录Ⅵ 转化反应
附录Ⅶ 碱裂解法提取质粒
附录Ⅷ 沉淀回收
攻读博士学位期间已发表学术论文
致谢
本文编号：3802863
【文章页数】：82 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
1 前言
1.1 橡胶树及其病害
1.2 橡胶树炭疽病及其病原
1.3 真菌的致病机制
1.3.1 效应蛋白在真菌致病机制中的作用
1.3.2 黑色素在真菌致病机制中的作用
1.3.3 活性氧在真菌致病机制中的作用
1.4 Cerato-platanin效应蛋白
1.5 本研究的目的意义
1.6 技术路线
2 材料与方法
2.1 植物材料、菌株、质粒、试剂
2.2 实验仪器
2.3 橡胶树胶孢炭疽菌CgCP1基因生物信息学分析
2.4 橡胶树炭疽病菌基因组DNA和总RNA的提取
2.4.1 橡胶树胶孢炭疽菌的DNA提取
2.4.2 橡胶树胶孢炭疽菌的总RNA提取
2.5 橡胶树炭疽菌CgCP1基因的克隆
2.6 载体的构建
2.6.1 敲除载体的构建
2.6.2 CgCP1互补载体的构建
2.6.3 原生质体瞬时表达载体(pUC19-35S::CgCP1-FLAG)的构建
2.6.4 原生质体亚细胞定位载体(pUC19-35s::CgCP1-GFP)的构建
2.6.5 植物表达载体(pEGAD-35s::CgCP1-GFP)的构建
2.6.6 植物表达载体提取质粒
2.7 橡胶树胶孢炭疽菌原生质体的制备和转化
2.8 胶孢炭疽菌突变株的鉴定
2.9 突变株的表型分析
2.10 半定量检测CgCP1基因表达量
2.11 突变株机械穿透力实验
2.12 突变株致病性分析
2.13 炭疽菌侵染橡胶树叶片活性氧检测
2.14 黑色素含量测定
2.15 黑色素合成酶表达量分析
2.16 CgCP1基因中的磷酸化位点点突变
2.16.1 扩增磷酸化位点突变的CgCP1基因
2.16.2 CgCP1磷酸化位点突变互补载体的构建
2.16.3 磷酸化位点突变株的鉴定
2.16.4 磷酸化位点突变株表型分析
2.17 植物表达载体转化农杆菌感受态细胞
2.18 农杆菌注射烟草瞬时表达CgCP1
2.19 烟草细胞坏死检测
2.20 橡胶树叶片原生质体制备
2.21 橡胶树原生质体总蛋白的提取
2.22 western blot检测CgCP1蛋白表达
2.23 橡胶树原生质体活性氧检测
2.24 CgCP1在橡胶树原生质体中的亚细胞定位
3 结果与分析
3.1 胶孢炭疽菌Cerato-platanin蛋白基因CgCP1的生物信息学分析
3.2 CgCP1敲除突变体菌株和互补菌株的鉴定
3.3 CgCP1基因对生长速率及产孢能力的影响
3.4 CgCP1基因对黑色素合成的影响
3.5 CgCP1蛋白的磷酸化对其功能的影响
3.6 CgCP1影响胶孢炭疽菌对橡胶树的致病力
3.7 CgCP1对胶孢炭疽菌菌丝机械穿透力的影响
3.8 CgCP1对植物先天免疫反应的影响
3.8.1 CgCP1诱导橡胶树叶片活性氧的产生
3.8.2 CgCP1对橡胶树防卫反应基因HbPR1、HbPR5表达的影响
3.8.3 CgCPl诱导烟草叶片坏死
3.9 CgCP1在橡胶树中的亚细胞定位
4 讨论
5 结论
参考文献
附录
附录Ⅰ 引物序列表
附录Ⅱ 原生质体制备过程中各种试剂
附录Ⅲ 本实验所用仪器及器材
附录Ⅳ 培养基及其他试剂配方
附录Ⅴ 凝胶片段回收
附录Ⅵ 转化反应
附录Ⅶ 碱裂解法提取质粒
附录Ⅷ 沉淀回收
攻读博士学位期间已发表学术论文
致谢
本文编号：3802863
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