猪链球菌毒力相关转录因子的筛选以及促炎蛋白HP1717促炎机理的研究
发布时间：2023-06-05 00:01
猪链球菌(Streptococcus suis,S.suis)是一种重要的人畜共患传染病病原。主要感染10周龄的仔猪,能够引起脑膜炎,败血症,肺炎,心内膜炎和关节炎,在全球范围内造成重大的经济损失,仅在美国每年就损失超过3亿美元。这种细菌不仅可以感染猪还可以感染其它哺乳动物和鸟类,在人群中S.suis可通过与感染的猪或猪肉副产品的密切接触传播给人类,并导致脑膜炎,关节炎,败血症和链球菌中毒样休克综合征(Streptococcus toxic shock like syndrome,STSLS)。自从1968年首次被报道人感染S.suis以来已经成为一种危害公共健康的重要的人畜共患病。仅仅从2009年到2013年,人感染S.suis病例的总数从700多个增加到1642个,这表明人S.suis感染变得越来越普遍。该病原体是具有荚膜多糖(CPS)的革兰氏阳性细菌,基于CPS抗原的不同,已经鉴定了S.suis的29种血清型。其中,血清型2型(streptococcus suis serotype 2,SS2)发病最多且危害最为严重。在1998年和2005年,中国爆发了两起大规模的人感染S.su...
【文章页数】：176 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略词表
第一章 文献综述
1.1 猪链球菌病
1.2 病原微生物学
1.3 流行病学
1.4 致病机制
1.4.1 致病过程的阶段
1.4.1.1 宿主的粘膜和/或上皮表面的粘附与定植
1.4.1.2 入侵深层组织并随血液循环扩散
1.4.1.3 穿过血脑屏障进入中枢神经系统
1.4.1.4 引起炎症风暴
1.4.2 免疫逃避的机制
1.4.2.1 逃避补体介导的杀伤的机制
1.4.2.2 逃避NET介导的杀伤机制
1.4.2.3 其它一些逃避机制
1.5 毒力相关因子
1.5.1 荚膜(CPS)
1.5.2 溶血素SLY
1.5.3 转录因子和调节因子
1.5.3.1 CcpA
1.5.3.2 Rgg
1.5.3.3 CovR
1.5.3.4 RevS
1.5.3.5 AdcR
1.5.3.6 PerR
1.5.3.7 双元调控系统(TCS)
1.5.3.7.1 Sal K/Sal R
1.5.3.7.2 CiaRH
1.5.3.7.3 Ihk/Irr
1.5.3.7.4 Vir R/Vir S
1.5.3.7.5 Nis K/Nis R
1.5.3.7.6 1910HK/RR
1.5.3.7.7 VraS/R
1.5.3.8小RNAs(s RNAs)调控
1.6 中毒样休克综合征(STSLS)
1.7 本研究目的
第二章 猪链球菌毒力相关转录因子的筛选
2.1 前言
2.2 材料
2.2.1 菌种和质粒
2.2.2 主要试剂
2.2.3 培养基和抗生素
2.2.4 主要仪器设备
2.2.5 试验动物
2.3 试验方法
2.3.1 细菌的培养
2.3.2 体内诱导实验
2.3.2.1 感染小鼠组织中SS2的分离
2.3.2.2 RNA提取
2.3.2.3 cDNA的合成
2.3.2.4 实时荧光定量PCR
2.3.3 菌株的构建
2.3.4 细菌生长曲线的测定
2.3.5 细菌形态学观察
2.3.5.1 革兰氏染色
2.3.5.2 透射电镜观察
2.3.6 突变体的小鼠感染实验
2.3.7 全血抑菌试验
2.3.8 体内载菌量及血液细胞因子的测定
2.3.8.1 体内载菌量
2.3.8.2 ELISA试剂盒检测血浆中细胞因子浓度
2.3.9 RNA-seq实验
2.3.10 RNA-seq结果的验证
2.3.11 统计分析
2.4 结果与分析
2.4.1 体内诱导初步筛选差异表达转录因子
2.4.2 各差异表达转录因子缺失突变体的构建
2.4.3 各基因缺失突变体生长曲线的测定
2.4.4 透射电镜观察各基因缺失突变体的荚膜
2.4.5 突变体小鼠感染实验
2.4.6 突变体在小鼠全血中的存活实验
2.4.7 突变体在小鼠体内的载菌量实验
2.4.8 突变体诱导小鼠血液细胞因子的检测
2.4.9 转录因子缺失后的差异表达基因分析
2.4.10 差异表达基因中的毒力相关基因的分析
2.5 讨论
2.5.1 筛选到的毒力相关转录因子的命名
2.5.2 转录因子、毒力和炎症之间的关系
2.5.3 ComR可能是一个毒力相关的全局调控因子
2.5.4 Sit R和Svx R与猪链球菌的免疫逃避有密切关系
2.6 小结
第三章 促炎蛋白HP1717促炎机理的研究
3.1 前言
3.2 材料
3.2.1 菌株和质粒
3.2.2 主要试剂
3.2.3 培养基和抗生素
3.2.4 主要仪器设备
3.2.5 主要缓冲液
3.2.6 蛋白表达和纯化相关试剂
3.2.7 SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western Blotting相关试剂
3.3 试验方法
3.3.1 重组表达载体构建
3.3.2 蛋白表达与纯化
3.3.2.1 小量表达试验
3.3.2.2 重组蛋白蛋白大量表达和纯化
3.3.2.3 重组蛋白的透析和浓缩
3.3.3 蛋白质的定量
3.3.4 重组蛋白去除内毒素
3.3.5 内毒素的测定
3.3.6 蛋白浓度测定
3.3.7 ELISA和实时荧光定量PCR检测重组蛋白的致炎性
3.3.7.1 重组蛋白与RAW264.7共孵育
3.3.7.2 RNA的提取
3.3.7.3 cDNA的合成
3.3.7.4 实时荧光定量PCR
3.3.8 小鼠腹腔巨噬细胞的分离
3.3.9 信号通路抑制试验
3.3.10 Western Blot技术验证
3.3.11 生长曲线的测定
3.3.12 人工感染小鼠
3.3.12.1 细菌计数
3.3.12.2 体内实验
3.4 结果与分析
3.4.1 SSU051717保守性研究
3.4.2 重组蛋白HP1717的原核表达
3.4.3 HP1717对RAW264.7细胞促炎作用的检测
3.4.4 HP1717的促炎作用的剂量依赖性检测
3.4.5 HP1717活性对其促炎作用的影响
3.4.6 HP1717刺激RAW264.7细胞后模式识别受体表达量检测
3.4.7 抗体抑制试验检测HP1717促炎作用的模式识别受体
3.4.8 基因缺失小鼠试验检测HP1717促炎作用的模式识别受体
3.4.9 信号通路抑制剂对促炎信号通路的检测
3.4.10 信号通路的磷酸化检测
3.4.11 突变体菌株Δ1717的构建
3.4.12 突变体菌株生长曲线的测定
3.4.13 突变体菌株革兰氏染色观察
3.4.14 突变体菌株的透射电镜观察
3.4.15 突变体菌株在小鼠全血中的存活分析
3.4.16 突变体菌株小鼠感染试验
3.4.17 突变体的体内载菌量检测
3.4.18 突变体菌株体内诱导炎症因子的能力的检测
3.5 讨论
3.5.1 HP1717促炎作用的独特性
3.5.2 HP1717促炎机理是多条信号通路共同作用的结果
3.5.3 Δ1717计数方法的独特性
3.5.4 CPS和炎症对于毒力的影响
3.6 小结
结论与展望
参考文献
附录
个人简历
致谢
本文编号：3831284
【文章页数】：176 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略词表
第一章 文献综述
1.1 猪链球菌病
1.2 病原微生物学
1.3 流行病学
1.4 致病机制
1.4.1 致病过程的阶段
1.4.1.1 宿主的粘膜和/或上皮表面的粘附与定植
1.4.1.2 入侵深层组织并随血液循环扩散
1.4.1.3 穿过血脑屏障进入中枢神经系统
1.4.1.4 引起炎症风暴
1.4.2 免疫逃避的机制
1.4.2.1 逃避补体介导的杀伤的机制
1.4.2.2 逃避NET介导的杀伤机制
1.4.2.3 其它一些逃避机制
1.5 毒力相关因子
1.5.1 荚膜(CPS)
1.5.2 溶血素SLY
1.5.3 转录因子和调节因子
1.5.3.1 CcpA
1.5.3.2 Rgg
1.5.3.3 CovR
1.5.3.4 RevS
1.5.3.5 AdcR
1.5.3.6 PerR
1.5.3.7 双元调控系统(TCS)
1.5.3.7.1 Sal K/Sal R
1.5.3.7.2 CiaRH
1.5.3.7.3 Ihk/Irr
1.5.3.7.4 Vir R/Vir S
1.5.3.7.5 Nis K/Nis R
1.5.3.7.6 1910HK/RR
1.5.3.7.7 VraS/R
1.5.3.8小RNAs(s RNAs)调控
1.6 中毒样休克综合征(STSLS)
1.7 本研究目的
第二章 猪链球菌毒力相关转录因子的筛选
2.1 前言
2.2 材料
2.2.1 菌种和质粒
2.2.2 主要试剂
2.2.3 培养基和抗生素
2.2.4 主要仪器设备
2.2.5 试验动物
2.3 试验方法
2.3.1 细菌的培养
2.3.2 体内诱导实验
2.3.2.1 感染小鼠组织中SS2的分离
2.3.2.2 RNA提取
2.3.2.3 cDNA的合成
2.3.2.4 实时荧光定量PCR
2.3.3 菌株的构建
2.3.4 细菌生长曲线的测定
2.3.5 细菌形态学观察
2.3.5.1 革兰氏染色
2.3.5.2 透射电镜观察
2.3.6 突变体的小鼠感染实验
2.3.7 全血抑菌试验
2.3.8 体内载菌量及血液细胞因子的测定
2.3.8.1 体内载菌量
2.3.8.2 ELISA试剂盒检测血浆中细胞因子浓度
2.3.9 RNA-seq实验
2.3.10 RNA-seq结果的验证
2.3.11 统计分析
2.4 结果与分析
2.4.1 体内诱导初步筛选差异表达转录因子
2.4.2 各差异表达转录因子缺失突变体的构建
2.4.3 各基因缺失突变体生长曲线的测定
2.4.4 透射电镜观察各基因缺失突变体的荚膜
2.4.5 突变体小鼠感染实验
2.4.6 突变体在小鼠全血中的存活实验
2.4.7 突变体在小鼠体内的载菌量实验
2.4.8 突变体诱导小鼠血液细胞因子的检测
2.4.9 转录因子缺失后的差异表达基因分析
2.4.10 差异表达基因中的毒力相关基因的分析
2.5 讨论
2.5.1 筛选到的毒力相关转录因子的命名
2.5.2 转录因子、毒力和炎症之间的关系
2.5.3 ComR可能是一个毒力相关的全局调控因子
2.5.4 Sit R和Svx R与猪链球菌的免疫逃避有密切关系
2.6 小结
第三章 促炎蛋白HP1717促炎机理的研究
3.1 前言
3.2 材料
3.2.1 菌株和质粒
3.2.2 主要试剂
3.2.3 培养基和抗生素
3.2.4 主要仪器设备
3.2.5 主要缓冲液
3.2.6 蛋白表达和纯化相关试剂
3.2.7 SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western Blotting相关试剂
3.3 试验方法
3.3.1 重组表达载体构建
3.3.2 蛋白表达与纯化
3.3.2.1 小量表达试验
3.3.2.2 重组蛋白蛋白大量表达和纯化
3.3.2.3 重组蛋白的透析和浓缩
3.3.3 蛋白质的定量
3.3.4 重组蛋白去除内毒素
3.3.5 内毒素的测定
3.3.6 蛋白浓度测定
3.3.7 ELISA和实时荧光定量PCR检测重组蛋白的致炎性
3.3.7.1 重组蛋白与RAW264.7共孵育
3.3.7.2 RNA的提取
3.3.7.3 cDNA的合成
3.3.7.4 实时荧光定量PCR
3.3.8 小鼠腹腔巨噬细胞的分离
3.3.9 信号通路抑制试验
3.3.10 Western Blot技术验证
3.3.11 生长曲线的测定
3.3.12 人工感染小鼠
3.3.12.1 细菌计数
3.3.12.2 体内实验
3.4 结果与分析
3.4.1 SSU051717保守性研究
3.4.2 重组蛋白HP1717的原核表达
3.4.3 HP1717对RAW264.7细胞促炎作用的检测
3.4.4 HP1717的促炎作用的剂量依赖性检测
3.4.5 HP1717活性对其促炎作用的影响
3.4.6 HP1717刺激RAW264.7细胞后模式识别受体表达量检测
3.4.7 抗体抑制试验检测HP1717促炎作用的模式识别受体
3.4.8 基因缺失小鼠试验检测HP1717促炎作用的模式识别受体
3.4.9 信号通路抑制剂对促炎信号通路的检测
3.4.10 信号通路的磷酸化检测
3.4.11 突变体菌株Δ1717的构建
3.4.12 突变体菌株生长曲线的测定
3.4.13 突变体菌株革兰氏染色观察
3.4.14 突变体菌株的透射电镜观察
3.4.15 突变体菌株在小鼠全血中的存活分析
3.4.16 突变体菌株小鼠感染试验
3.4.17 突变体的体内载菌量检测
3.4.18 突变体菌株体内诱导炎症因子的能力的检测
3.5 讨论
3.5.1 HP1717促炎作用的独特性
3.5.2 HP1717促炎机理是多条信号通路共同作用的结果
3.5.3 Δ1717计数方法的独特性
3.5.4 CPS和炎症对于毒力的影响
3.6 小结
结论与展望
参考文献
附录
个人简历
致谢
本文编号：3831284
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