Nur77对心肌成纤维细胞功能影响及野黄芩苷调控Nur77抑制心肌纤维化相关研究

发布时间：2023-03-29 21:32

　　心肌纤维化(myocardial fibrosis,MF)是以心肌间质或血管周围细胞外基质(extracellular matrix,ECM)过度沉积为主要特征的一种病理反应。研究表明,心肌纤维化是大多数心血管疾病(Cardiovascular disease,CVD)发展到终末期的必然生理过程。因此,阻断或逆转心肌纤维化是治疗心血管疾病的重要目标之一。心肌成纤维细胞(Cardiac fibroblasts,CFs)是产生细胞外基质的中心细胞,其激活是心肌纤维化发生的中心环节,在心肌纤维化过程中发挥关键的作用。众多细胞因子、信号通路参与调控心肌成纤维细胞的激活,但其激活的确切机制仍在探索过程中。近年来,国内外学者开始关注核转录因子在心肌纤维化发生发展过程中的作用。最新研究表明,孤儿核受体Nur77可负反馈调控多种实验性纤维化疾病,这也提示Nur77可能成为抗心肌纤维化的潜在靶点。野黄芩苷是一种黄酮类单体,具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎等药理活性。有报道显示野黄芩苷可以通过ERK信号通路抑制心肌梗死所致的大鼠心肌纤维化,但其抗心肌纤维化相关的细胞及分子机制尚未完全明确。本课题组前期研究发现,金...

【文章页数】：124 页

【学位级别】：博士

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摘要
ABSTRACT
引言
第一章 Nur77在心肌纤维化组织及体外激活的原代心肌成纤维细胞中的表达情况
    1.1 材料与仪器
        1.1.1 实验材料
        1.1.2 实验仪器
        1.1.3 实验动物
        1.1.4 细胞来源
    1.2 实验方法
        1.2.1 ANGⅡ诱导的小鼠心肌纤维化模型建立
        1.2.2 原代心肌成纤维细胞分离培养及鉴定
        1.2.3 组织石蜡包埋切片
        1.2.4 Masson’s trichrome染色检测心肌组织胶原沉积
        1.2.5 免疫组织化学检测蛋白表达
        1.2.6 免疫荧光检测组织蛋白表达
        1.2.7 组织总RNA提取
        1.2.8 细胞总RNA提取
        1.2.9 逆转录
        1.2.10 RT-q PCR
        1.2.11 Western blot实验
        1.2.12 免疫荧光
        1.2.13 统计学处理
    1.3 结果
        1.3.1 Nur77在小鼠纤维化心肌组织中的表达
        1.3.2 Nur77在体外原代心肌成纤维细胞中的表达情况
    1.4 讨论
    1.5 小结
第二章 调控Nur77对心肌成纤维细胞功能的影响
    2.1 材料与仪器
        2.1.1 实验材料
        2.1.2 实验仪器
        2.1.3 细胞来源
    2.2 实验方法
        2.2.1 原代心肌成纤维细胞分离培养
        2.2.2 293T细胞培养
        2.2.3 腺病毒Ad Nur77、Ad NC扩增
        2.2.4 腺病毒感染原代心肌成纤维细胞
        2.2.5 si Nur77 RNA转染原代心肌成纤维细胞
        2.2.6 细胞总RNA提取、逆转录及RT-q PCR
        2.2.7 Western blot实验
        2.2.8 细胞计数法检测过表达Nur77对原代心肌成纤维细胞增殖的影响
        2.2.9 CCK-8 法检测过表达和敲减Nur77 对原代心肌成纤维细胞增殖的影响
        2.2.10 划痕法检测过表达或敲减Nur77对原代心肌成纤维细胞迁移的影响
        2.2.11 Transwell法检测过表达或敲减Nur77对原代心肌成纤维细胞迁移的影响
        2.2.12 细胞周期测定
        2.2.13 细胞凋亡测定
        2.2.14 统计学处理
    2.3 实验结果
        2.3.1 过表达Nur77抑制原代心肌成纤维细胞增殖
        2.3.2 过表达Nur77抑制ANG Ⅱ诱导的细胞周期相关蛋白表达
        2.3.3 过表达Nur77抑制ANG Ⅱ诱导的原代心肌成纤维细胞表型转化和胶原合成
        2.3.4 过表达Nur77抑制ANG Ⅱ诱导的原代心肌成纤维细胞的迁移
        2.3.5 过表达Nur77对原代心肌成纤维细胞凋亡数无影响
        2.3.6 敲减Nur77促进原代心肌成纤维细胞中纤维化相关基因表达
        2.3.7 敲减Nur77促进原代心肌成纤维细胞的增殖
        2.3.8 敲减Nur77促进原代心肌成纤维细胞的迁移
        2.3.9 敲减Nur77改变原代心肌成纤维细胞周期
        2.3.10 敲减Nur77抑制原代心肌成纤维细胞凋亡
    2.4 讨论
    2.5 小结
第三章 野黄芩苷调控Nur77对心肌成纤维细胞功能影响及相关机制研究
    3.1 材料与仪器
        3.1.1 实验材料
        3.1.2 实验仪器
        3.1.3 细胞来源
    3.2 实验方法
        3.2.1 原代心肌成纤维细胞分离培养
        3.2.2 siRNA转染原代心肌成纤维细胞
        3.2.3 细胞总RNA提取、逆转录
        3.2.4 RT-qPCR实验
        3.2.5 Western blot实验
        3.2.6 CCK-8细胞增殖实验
        3.2.7 Transwell实验
        3.2.8 细胞免疫荧光
        3.2.9 统计学处理
    3.3 结果
        3.3.1 野黄芩苷调控Nur77抑制原代心肌成纤维细胞的增殖
        3.3.2 野黄芩苷调控Nur77抑制原代心肌成纤维细胞的迁移
        3.3.3 野黄芩苷调控Nur77抑制原代心肌成纤维细胞中纤维化相关基因的表达
        3.3.4 野黄芩苷调控Nur77抑制原代心肌成纤维细胞表型转化
        3.3.5 野黄芩苷对原代心肌成纤维细胞中Nur77及其磷酸化蛋白表达的调控
        3.3.6 野黄芩苷通过ERK1/2/p38 MAPK信号通路调控Nur77 及其磷酸化蛋白表达
    3.4 讨论
    3.5 小结
第四章 野黄芩苷调控Nur77抑制ANG Ⅱ诱导的小鼠心肌纤维化
    4.1 .实验材料与仪器
        4.1.1 实验材料
        4.1.2 实验仪器
        4.1.3 实验动物
    4.2 实验方法
        4.2.1 小鼠心肌纤维化动物模型的制备
        4.2.2 Masson’s trichrome染色
        4.2.3 HE染色
        4.2.4 免疫组织化学检测蛋白表达
        4.2.5 组织总RNA提取、逆转录和RT-q PCR
        4.2.6 胶原面积半定量分析
        4.2.7 Western blot实验
        4.2.8 统计学处理
    4.3 实验结果
        4.3.1 野黄芩苷调控Nur77 抑制ANG Ⅱ诱导的小鼠心肌组织中胶原沉积
        4.3.2 胶原染色面积测定
        4.3.3 野黄芩苷调控Nur77 抑制ANG Ⅱ诱导的心肌纤维化相关基因表达
        4.3.4 野黄芩苷调控Nur77 及其磷酸化蛋白抑制ANG Ⅱ诱导的心肌纤维化
        4.3.5 野黄芩苷对ANGⅡ激活的纤维化心肌组织中相关信号通路的影响
    4.4 讨论
    4.5 小结
创新点
结论
致谢
参考文献
附录
    附录一 综述 心肌纤维化发病机制及中医药防治研究进展
        参考文献
    附录二 在校期间发表文章
附件



本文编号：3774522