类风湿关节炎微生物组与免疫机制的研究

发布时间：2023-04-03 21:43

　　背景介绍:类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种以慢性、小关节对称的炎症性为主的全身性的自身免疫性疾病,是导致我国人口残疾的第二大原因。此外,虽然甲氨蝶呤等改善病情的抗风湿药能缓解病情,却无法彻底根治,而且有严重的副作用。目前RA已成为危害人类健康的重要疾病之一,但其病因尚不清楚。RA被认为与细菌感染密切相关,但其作用机制不明确。2015年7月,北京协和医院和华大基因等机构的研究人员共同合作完成了RA患者口腔和肠道微生物元基因组研究发现口腔和肠道菌群变化是病理生理和疾控的重要环节。发表在《自然》杂志。但是这些口腔和肠道菌群参与RA的具体机制不明确。2020年3月11日,加州大学圣地亚哥分校医学院研究人员开发了一种新颖的方法,可以通过简单地分析血液中存在的微生物DNA的模式来识别癌症,发表在《自然》杂志。RA的血和滑液是否存在微生物DNA不明确。我们前期研究证明RA的肠道菌群失衡,并发现普雷沃氏菌(Prevotella copri)、牙龈卟啉单胞菌、拟杆菌等显著表达失衡。但是菌群如何参与RA的具体发病机制均不清楚。为了能够深入研究参与RA的机制,我们采用大量...

【文章页数】：114 页

【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
英文缩略语表
第一章 前言
    1.1 类风湿关节炎的概述
        1.1.1 类风湿关节炎的发病病因
        1.1.2 类风湿关节炎临床表现
        1.1.3 类风湿关节炎临床诊断
        1.1.4 类风湿关节炎临床治疗
    1.2 研究背景及意义
    1.3 国内外研究进展
        1.3.1 微生物可能是导致RA发病的重要病理因素
        1.3.2 肠道微生物和口腔微生物均可能导致RA的发生
            1.3.2.1 肠道微生物与RA发病的关系
            1.3.2.2 口腔菌群与RA发病的关系
        1.3.3 微生物在风湿性疾病中的代谢作用机制
        1.3.4 滑膜组织和滑膜液中是否存在微生物的核酸序列得到关注
    1.4 本研究的研究内容及技术路线
    1.5 本研究的思路拟解决的关键科学问题
第二章 RA中微生物与其代谢物的作用机制研究
    2.1 引言
    2.2 材料与方法
        2.2.1 临床样本
        2.2.2 试剂耗材
        2.2.3 仪器设备
        2.2.4 实验方法
            2.2.4.1 滑膜液或唾液细菌DNA提取方法
            2.2.4.2 滑膜组织细菌DNA提取方法
            2.2.4.3 粪便DNA提取方法
            2.2.4.4 PCR产物扩增
            2.2.4.5 ELISA检测炎性因子的表达
            2.2.4.6 菌群数据生物统计学分析
            2.2.4.7 非靶向代谢组学
            2.2.4.8 非靶向代谢组学数据分析
            2.2.4.9 特异菌群目的基因的获取及PCR反应验证
            2.2.4.10 琼脂糖凝胶电泳
            2.2.4.11 验证回收PCR产物
            2.2.4.12 质粒构建
            2.2.4.13 实时荧光定量PCR
            2.2.4.14 实时荧光定量PCR数据统计学分析
    2.3 结果
        2.3.1 微生物组整体测序PCoA分析
        2.3.2 整体微生物组的组成结构分布
        2.3.3 RA与 OA之间菌群差异分析
        2.3.4 基于PICRUSt算法预测微生物的功能
        2.3.5 滑膜液中非靶向代谢组学整体PCoA分析
        2.3.6 滑膜液中代谢产物的整体结构
        2.3.7 代谢物的KEGG通路分析
        2.3.8 RA肠道菌群、口腔菌群与滑膜液中菌的核酸片段的一致性
        2.3.9 PCR定量分析结果
            2.3.9.1 拟杆菌的定量结果
            2.3.9.2 普雷沃氏菌的定量结果
            2.3.9.3 牙龈卟啉单胞菌的定量结果
    2.4 讨论
    2.5 结论
第三章 益生菌对类风湿关节炎成纤维细胞的作用机制
    3.1 引言
    3.2 材料及方法
        3.2.1 样本采集
        3.2.2 主要试剂及耗材
        3.2.3 实验方法
            3.2.3.1 类风湿关节炎滑膜成纤维细胞的原代培养
            3.2.3.2 类风湿关节炎滑膜成纤维细胞的传代培养
            3.2.3.3 原代培养滑膜成纤维细胞的鉴定
            3.2.3.4 滑膜细胞计数
            3.2.3.5 益生菌群刺激类风湿滑膜成纤维细胞
            3.2.3.6 采用MTS法检测细胞增殖能力
            3.2.3.7 采用划痕法检测细胞迁移能力
            3.2.3.8 采用Transwell法检测细胞侵袭能力
            3.2.3.9 ELISA酶联免疫实验方法检测炎性因子水平
            3.2.3.10 统计学方法
    3.3 结果
        3.3.1 MTS方法检测益生菌干预细胞增殖能力
        3.3.2 划痕法检测益生菌干预表对RA FLS迁移能力的影响
        3.3.3 Transwell方法检测益生菌干预对RA FLS侵袭能力的影响
        3.3.4 ELISA法检测炎性因子的表达
    3.4 讨论
    3.5 结论
第四章 益生菌群对胶原诱导性关节炎的机制研究
    4.1 引言
    4.2 材料与方法
        4.2.1 材料
            4.2.1.1 实验动物
            4.2.1.2 主要试剂耗材
            4.2.1.3 主要仪器
        4.2.2 实验方法
            4.2.2.1 构建Ⅱ型胶原诱导性DBA1 小鼠关节炎模型
            4.2.2.2 关节炎的评分
            4.2.2.3 病理组织学分析
            4.2.2.4 小鼠CT扫描骨骼的变化
            4.2.2.5 小鼠粪便样本收集
            4.2.2.6 粪便DNA提取方法同2.2.4.3
            4.2.2.7 PCR产物扩增
            4.2.2.8 ELISA法检测小鼠血清中IL-17、IL-6、IL-1α的水平
    4.3 结果
        4.3.1 胶原诱导性关节小鼠诱导成功
        4.3.2 16SrRNA V1-V2 区测序分析整体微生物组变化
        4.3.3 胶原诱导性关节炎小鼠肠道菌群β-多样性差异
        4.3.4 通过Veen图比较各组OTU分布差异
        4.3.5 胶原诱导性关节炎小鼠肠道菌群的门分类水平差异
        4.3.6 胶原诱导性关节炎小鼠的肠道菌群属分类水平的差异
        4.3.7 各组胶原诱导性关节炎小鼠肠道菌群差异分析
        4.3.8 CT扫描显示益生菌对CIA小鼠具有保护作用
        4.3.9 病理组织学分析益生菌制剂干预CIA小鼠结构
        4.3.10 益生菌制剂可调节炎性细胞因子水平
    4.4 讨论
    4.5 结论
总结与展望
参考文献
致谢
攻读学位期间所取得的成果



本文编号：3781197