MiR-181a-5p通过靶向调控Egr1抑制Egr1/TGF-β/Smad信号通路延缓肝细胞癌的增殖
发布时间：2023-05-19 02:53
目的和意义肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)的发生率和致死率在全世界恶性肿瘤中都名列前茅。早期生长反应因子1(early growth response factor 1,Egr1)在多种肿瘤病理进程中发挥重要调控作用。但Egr1在HCC中的作用及机制尚不明确。研究证实多种microRNA(miRNA)参与HCC的调控,但尚缺乏靶向作用Egr1调控HCC的研究。本课题拟通过体内体外实验,探讨Egr1在HCC细胞增殖中的作用和机制及靶向调控Egr1基因的上游miRNA,为深入理解HCC的发病机制和寻找新的治疗靶点奠定理论基础。研究方法在人类蛋白质图谱相关网站查询Egr1、TGF-β1在人HCC中的表达情况后,选取2015-2016年经术后病理确诊的20对人HCC及癌旁标本,qRT-PCR和Western b1ot检测标本中Egr1、TGF-β1基因的mRNA和蛋白表达。选取人HCC细胞株HepG2和Hep3B进行细胞实验。通过瞬时转染改变细胞内Egr1的表达,qRT-PCR和Western blot检测转染细胞中Egr1、TGF-β1基因的mRNA和蛋...
【文章页数】：125 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
前言
第1章 Egr1和TGF-β1基因在临床HCC组织标本中表达
1.1 实验材料及仪器
1.1.1 实验材料
1.1.2 主要试剂配制
1.1.3 实验仪器
1.2 实验方法及步骤
1.2.1 人类蛋白质图谱上的查询Egr1及TGF-β1免疫组化染色
1.2.2 实验分组
1.2.3 实时荧光定量PCR(临床组织标本)
1.2.4 免疫印迹法(临床组织标本)
1.2.5 统计学方法
1.3 实验结果
1.3.1 人类蛋白质图谱中Egr1和TGF-β1在HCC的免疫组化染色
1.3.2 临床HCC及癌旁的组织标本中Egr1和TGF-β 1基因表达情况
1.4 讨论
第2章 Egr1基因对HCC细胞增殖功能的影响
2.1 实验材料及仪器
2.1.1 实验材料
2.1.2 主要试剂配制
2.1.3 实验仪器
2.2 实验方法及步骤
2.2.1 细胞培养
2.2.2 细胞计数与种板
2.2.3 质粒扩增、提取及检测
2.2.4 同步化处理与实验分组
2.2.5 细胞转染
2.2.6 实时荧光定量PCR(细胞)
2.2.7 免疫印迹法(细胞)
2.2.8 CCK-8法测定细胞增殖
2.2.9 统计学方法
2.3 实验结果
2.3.1 转染pENTER-Egr1质粒DNA的HepG2和Hep3B细胞中Egr1和TGF-β1的表达情况
2.3.2 转染pENTER-Egr1质粒DNA的HepG2和Hep3B细胞增殖情况
2.3.3 转染siEgr1的HepG2和Hep3B细胞中Egr1和TGF-β1基因的表达情况
2.3.4 转染siEgr1沉默Egr1表达的HepG2和Hep3B细胞增殖情况
2.4 讨论
第3章 HCC细胞中Egr1基因对TGF-β1/Smad信号通路的调控作用
3.1 实验材料及仪器
3.1.1 实验材料
3.1.2 主要试剂配制
3.2 实验方法及步骤
3.2.1 细胞培养
3.2.2 细胞计数与种板
3.2.3 质粒扩增、提取及检测
3.2.4 同步化处理与实验分组
3.2.5 细胞转染
3.2.6 免疫印迹法(细胞)
3.2.7 统计学方法
3.3 实验结果
3.3.1 HCC细胞过表达Egr1基因对TGF-β1/Smad信号通路的影响
3.3.2 HCC细胞沉默Egr1的表达对TGF-β1/Smad信号通路的影响
3.4 讨论
第4章 HCC细胞中miR-181a-5p靶向抑制Egr1基因的表达
4.1 实验材料及仪器
4.1.1 实验材料
4.1.2 主要试剂配制
4.1.3 实验仪器
4.2 实验方法及步骤
4.2.1 预测与Egr1 mRNA结合的miRNAs
4.2.2 细胞培养
4.2.3 细胞计数与种板
4.2.4 同步化处理与实验分组
4.2.5 实时荧光定量PCR(细胞)
4.2.6 双荧光素酶报告基因
4.2.7 统计学方法
4.3 实验结果
4.3.1 靶向调节Egr1基因的miRNA的筛选
4.3.2 临床HCC组织标本中miR-181a-5p的表达及与Egr1基因表达的相关性分析
4.3.3 Egr1基因3'UTR载体的构建
4.3.4 双萤光素酶报告基因检测
4.4 讨论
第5章 MiR-181a-5p抑制Egr1/TGF-β信号通路延缓HCC细胞增殖的研究
5.1 实验材料及仪器
5.1.1 实验材料
5.1.2 主要试剂配制
5.1.3 实验仪器
5.2 实验方法及步骤
5.2.1 细胞培养
5.2.2 细胞计数与种板
5.2.3 同步化处理
5.2.4 细胞转染
5.2.5 实时荧光定量PCR(细胞)
5.2.6 免疫印迹法(细胞)
5.2.7 CCK-8法测定细胞增殖
5.2.8 统计学方法
5.3 实验结果
5.3.1 HCC细胞miR-181a-5p表达下调对Egr1、TGF-β基因的表达的影响
5.3.2 HCC细胞转染miR-181a-5p inhibitor对细胞增殖功能的影响
5.3.3 HCC细胞miR-181a-5p表达上调对Egr1、TGF-β基因的表达的影响
5.3.4 HCC细胞转染miR-181a-5p mimics对细胞增殖功能的影响
5.4 讨论
第6章 MiR-181a-5p靶向调节Egr1基因的表达介导HCC细胞增殖的研究
6.1 实验材料及仪器
6.1.1 实验材料
6.1.2 主要试剂配制
6.1.3 实验仪器
6.2 实验方法及步骤
6.2.1 细胞培养
6.2.2 细胞计数与种板
6.2.3 同步化处理及实验分组
6.2.4 细胞转染
6.2.5 实时荧光定量PCR(细胞)
6.2.6 免疫印迹法(细胞)
6.2.7 CCK-8法测定细胞增殖
6.2.8 统计学方法
6.3 实验结果
6.3.1 miR-181a-5p inhibitor与siEgr1共转后对HepG2和Hep3B细胞Egr1、TGF-β1基因表达的影响
6.3.2 miR-181a-5p inhibitor与siEgr1共转后对HepG2和Hep3B细胞增殖功能的影响
6.4 讨论
参考文献
英文缩略词
全文小结
攻读学位期间发表论文
致谢
本文编号：3819514
【文章页数】：125 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
前言
第1章 Egr1和TGF-β1基因在临床HCC组织标本中表达
1.1 实验材料及仪器
1.1.1 实验材料
1.1.2 主要试剂配制
1.1.3 实验仪器
1.2 实验方法及步骤
1.2.1 人类蛋白质图谱上的查询Egr1及TGF-β1免疫组化染色
1.2.2 实验分组
1.2.3 实时荧光定量PCR(临床组织标本)
1.2.4 免疫印迹法(临床组织标本)
1.2.5 统计学方法
1.3 实验结果
1.3.1 人类蛋白质图谱中Egr1和TGF-β1在HCC的免疫组化染色
1.3.2 临床HCC及癌旁的组织标本中Egr1和TGF-β 1基因表达情况
1.4 讨论
第2章 Egr1基因对HCC细胞增殖功能的影响
2.1 实验材料及仪器
2.1.1 实验材料
2.1.2 主要试剂配制
2.1.3 实验仪器
2.2 实验方法及步骤
2.2.1 细胞培养
2.2.2 细胞计数与种板
2.2.3 质粒扩增、提取及检测
2.2.4 同步化处理与实验分组
2.2.5 细胞转染
2.2.6 实时荧光定量PCR(细胞)
2.2.7 免疫印迹法(细胞)
2.2.8 CCK-8法测定细胞增殖
2.2.9 统计学方法
2.3 实验结果
2.3.1 转染pENTER-Egr1质粒DNA的HepG2和Hep3B细胞中Egr1和TGF-β1的表达情况
2.3.2 转染pENTER-Egr1质粒DNA的HepG2和Hep3B细胞增殖情况
2.3.3 转染siEgr1的HepG2和Hep3B细胞中Egr1和TGF-β1基因的表达情况
2.3.4 转染siEgr1沉默Egr1表达的HepG2和Hep3B细胞增殖情况
2.4 讨论
第3章 HCC细胞中Egr1基因对TGF-β1/Smad信号通路的调控作用
3.1 实验材料及仪器
3.1.1 实验材料
3.1.2 主要试剂配制
3.2 实验方法及步骤
3.2.1 细胞培养
3.2.2 细胞计数与种板
3.2.3 质粒扩增、提取及检测
3.2.4 同步化处理与实验分组
3.2.5 细胞转染
3.2.6 免疫印迹法(细胞)
3.2.7 统计学方法
3.3 实验结果
3.3.1 HCC细胞过表达Egr1基因对TGF-β1/Smad信号通路的影响
3.3.2 HCC细胞沉默Egr1的表达对TGF-β1/Smad信号通路的影响
3.4 讨论
第4章 HCC细胞中miR-181a-5p靶向抑制Egr1基因的表达
4.1 实验材料及仪器
4.1.1 实验材料
4.1.2 主要试剂配制
4.1.3 实验仪器
4.2 实验方法及步骤
4.2.1 预测与Egr1 mRNA结合的miRNAs
4.2.2 细胞培养
4.2.3 细胞计数与种板
4.2.4 同步化处理与实验分组
4.2.5 实时荧光定量PCR(细胞)
4.2.6 双荧光素酶报告基因
4.2.7 统计学方法
4.3 实验结果
4.3.1 靶向调节Egr1基因的miRNA的筛选
4.3.2 临床HCC组织标本中miR-181a-5p的表达及与Egr1基因表达的相关性分析
4.3.3 Egr1基因3'UTR载体的构建
4.3.4 双萤光素酶报告基因检测
4.4 讨论
第5章 MiR-181a-5p抑制Egr1/TGF-β信号通路延缓HCC细胞增殖的研究
5.1 实验材料及仪器
5.1.1 实验材料
5.1.2 主要试剂配制
5.1.3 实验仪器
5.2 实验方法及步骤
5.2.1 细胞培养
5.2.2 细胞计数与种板
5.2.3 同步化处理
5.2.4 细胞转染
5.2.5 实时荧光定量PCR(细胞)
5.2.6 免疫印迹法(细胞)
5.2.7 CCK-8法测定细胞增殖
5.2.8 统计学方法
5.3 实验结果
5.3.1 HCC细胞miR-181a-5p表达下调对Egr1、TGF-β基因的表达的影响
5.3.2 HCC细胞转染miR-181a-5p inhibitor对细胞增殖功能的影响
5.3.3 HCC细胞miR-181a-5p表达上调对Egr1、TGF-β基因的表达的影响
5.3.4 HCC细胞转染miR-181a-5p mimics对细胞增殖功能的影响
5.4 讨论
第6章 MiR-181a-5p靶向调节Egr1基因的表达介导HCC细胞增殖的研究
6.1 实验材料及仪器
6.1.1 实验材料
6.1.2 主要试剂配制
6.1.3 实验仪器
6.2 实验方法及步骤
6.2.1 细胞培养
6.2.2 细胞计数与种板
6.2.3 同步化处理及实验分组
6.2.4 细胞转染
6.2.5 实时荧光定量PCR(细胞)
6.2.6 免疫印迹法(细胞)
6.2.7 CCK-8法测定细胞增殖
6.2.8 统计学方法
6.3 实验结果
6.3.1 miR-181a-5p inhibitor与siEgr1共转后对HepG2和Hep3B细胞Egr1、TGF-β1基因表达的影响
6.3.2 miR-181a-5p inhibitor与siEgr1共转后对HepG2和Hep3B细胞增殖功能的影响
6.4 讨论
参考文献
英文缩略词
全文小结
攻读学位期间发表论文
致谢
本文编号：3819514
本文链接：https://www.wllwen.com/shoufeilunwen/yxlbs/3819514.html
教材专著