乳腺癌中BAP31结合SERCA2共同维持细胞内质网钙稳态和凋亡抵抗
发布时间：2024-03-12 19:36
乳腺癌是全球女性发病率、死亡率第一的癌症,在癌症治疗中一直被高度关注。新发现的癌症-睾丸抗原BAP31分子,是一个内质网上的分子伴侣蛋白,它能够参与很多生物过程,但它在乳腺癌中的功能尚未被深入研究。在本研究中,我们在大量临床病例样本中观察到,乳腺癌组织样本相对于正常组织样本和癌旁组织样本的BAP31基因异常高表达,并且高表达BAP31基因的病人总体预后更差,无远端转移生存率更差。而且BAP31基因的高表达与肿瘤更高的分级、更高的恶性程度都具有一定的正相关性。因此我们决定在乳腺癌细胞系和小鼠模型中深入探究BAP31基因的功能以及作用机制。在本研究中我们发现BAP31基因能够广泛影响乳腺癌细胞的表型,BAP31基因的敲低能够抑制乳腺癌细胞的增殖、侵袭和凋亡抵抗。我们通过蛋白质免疫共沉淀、银染和质谱的方法,找到了与BAP31分子相结合的蛋白SERCA2。后者是细胞内质网上的主要负责将钙离子逆浓度梯度运输进内质网腔的钙离子泵,它和内质网、细胞膜上的其他钙离子泵和通道共同维持细胞的钙离子稳态。我们发现BAP31与SERCA2的直接结合并不影响各自的蛋白水平,但是BAP31基因的敲低能够使内质网腔...
【文章页数】：113 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第1章 绪论
1.1 癌症概述
1.1.1 癌症的现状
1.1.2 癌症的生物学特性
1.1.3 癌症的诊断与治疗
1.2 乳腺癌概述
1.2.1 乳腺癌的诱因和预防
1.2.2 乳腺癌的分期和分类
1.2.3 乳腺癌的诊断和治疗
1.3 细胞凋亡与肿瘤转移
1.3.1 原位肿瘤的转移过程
1.3.2 细胞凋亡及失巢凋亡
1.4 细胞内质网与钙离子稳态
1.4.1 钙离子与内质网应激
1.4.2 内质网钙离子泵SERCA2
1.4.3 内质网分子伴侣BAP31
第2章 实验结果与讨论
2.1 BAP31在乳腺癌中高表达并与不良预后相关
2.1.1 BAP31在乳腺癌中高表达
2.1.2 BAP31在乳腺癌中与不良预后相关
2.1.3 BAP31在乳腺癌细胞系中高表达
2.2 BAP31与SERCA2相互作用
2.2.1 BAP31与SERCA2分子直接结合
2.2.2 BAP31影响SERCA2转运钙离子功能
2.2.3 BAP31与SERCA2分子协同维持细胞ER稳态
2.3 BAP31在乳腺癌细胞恶性表型中的作用
2.3.1 BAP31影响乳腺癌细胞增殖
2.3.2 BAP31影响乳腺癌细胞克隆形成、非锚定生长能力
2.3.3 BAP31影响乳腺癌细胞转移侵袭
2.3.4 BAP31影响乳腺癌细胞凋亡和失巢凋亡
2.4 SERCA2在乳腺癌细胞恶性表型中的作用
2.4.1 SERCA2影响乳腺癌细胞增殖
2.4.2 SERCA2影响乳腺癌细胞克隆形成、非锚定生长能力
2.4.3 SERCA2影响乳腺癌细胞转移侵袭
2.4.4 SERCA2影响乳腺癌细胞凋亡和失巢凋亡
2.5 BAP31通过SERCA2促进乳腺癌细胞增殖转移
2.6 BAP31在体内维持乳腺癌生长和转移
2.6.1 BAP31影响乳腺癌原位肿瘤生长
2.6.2 BAP31影响乳腺癌原位组织浸润和远端转移能力
2.7 结果与讨论
第3章 材料与方法
3.1 临床组织样本的收集分析
3.2 细胞培养
3.3 质粒载体的构建
3.3.1 BAP31和SERCA2过表达载体的构建
3.3.2 BAP31和SERCA2敲低载体的构建
3.3.3 带Flag标签的BAP31截短蛋白载体构建
3.4 慢病毒的包装和稳转细胞的建立
3.5 细胞和组织总RNA的抽提和检测
3.5.1 病理样本的总RNA抽提
3.5.2 细胞的总RNA抽提
3.5.3 cDNA的合成和实时荧光定量PCR
3.6 细胞总蛋白的提取和检测
3.7 细胞功能检测实验
3.7.1 细胞活力和克隆形成能力测定
3.7.2 细胞周期的检测
3.7.3 细胞凋亡和失巢凋亡的检测
3.7.4 细胞软琼脂非锚定生长能力检测
3.7.5 细胞基质胶培养实验
3.7.6 细胞迁移和侵袭能力检测
3.7.7 细胞划痕愈合能力检测
3.7.8 细胞分散实验
3.8 蛋白质免疫沉淀实验
3.9 银染实验
3.10 免疫荧光实验
3.11 细胞内质网钙离子外流的检测
3.12 肿瘤切片的免疫组织化学染色
3.13 小鼠原位脂肪垫荷瘤实验
3.14 尾静脉小鼠肿瘤肺转移实验
3.15 生物信息学分析及统计
参考文献
附录A 实验试剂
附录B 主要实验仪器设备
附录C 实验室常规试剂溶液配制
附录D 常规实验方法
细胞DNA抽提
Trizol法抽提RNA
去除RNA中的DNA残留
逆转录PCR (RT-PCR)
实时定量PCR
PCR片段扩增
PCR产物及凝胶回收
酶切反应
连接反应
感受态细胞的制备
细菌转化
质粒小量抽提
质粒中量抽提
蛋白浓度测定
Western Blot
蛋白抽提
MTT细胞活力测定
细胞计数实验
细胞贴壁培养克隆形成实验
碘化丙啶(PI)法检测细胞周期
Transwell迁移和侵袭实验
划痕愈合实验
细胞克隆分散实验
Annexin V/PI双染色流式检测细胞凋亡实验
免疫荧光技术
免疫组织化学染色
组织切片TUNEL实验
附录E 引物序列和抗体信息
致谢
在读期间发表的学术论文与取得的研究成果
本文编号：3926774
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【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第1章 绪论
1.1 癌症概述
1.1.1 癌症的现状
1.1.2 癌症的生物学特性
1.1.3 癌症的诊断与治疗
1.2 乳腺癌概述
1.2.1 乳腺癌的诱因和预防
1.2.2 乳腺癌的分期和分类
1.2.3 乳腺癌的诊断和治疗
1.3 细胞凋亡与肿瘤转移
1.3.1 原位肿瘤的转移过程
1.3.2 细胞凋亡及失巢凋亡
1.4 细胞内质网与钙离子稳态
1.4.1 钙离子与内质网应激
1.4.2 内质网钙离子泵SERCA2
1.4.3 内质网分子伴侣BAP31
第2章 实验结果与讨论
2.1 BAP31在乳腺癌中高表达并与不良预后相关
2.1.1 BAP31在乳腺癌中高表达
2.1.2 BAP31在乳腺癌中与不良预后相关
2.1.3 BAP31在乳腺癌细胞系中高表达
2.2 BAP31与SERCA2相互作用
2.2.1 BAP31与SERCA2分子直接结合
2.2.2 BAP31影响SERCA2转运钙离子功能
2.2.3 BAP31与SERCA2分子协同维持细胞ER稳态
2.3 BAP31在乳腺癌细胞恶性表型中的作用
2.3.1 BAP31影响乳腺癌细胞增殖
2.3.2 BAP31影响乳腺癌细胞克隆形成、非锚定生长能力
2.3.3 BAP31影响乳腺癌细胞转移侵袭
2.3.4 BAP31影响乳腺癌细胞凋亡和失巢凋亡
2.4 SERCA2在乳腺癌细胞恶性表型中的作用
2.4.1 SERCA2影响乳腺癌细胞增殖
2.4.2 SERCA2影响乳腺癌细胞克隆形成、非锚定生长能力
2.4.3 SERCA2影响乳腺癌细胞转移侵袭
2.4.4 SERCA2影响乳腺癌细胞凋亡和失巢凋亡
2.5 BAP31通过SERCA2促进乳腺癌细胞增殖转移
2.6 BAP31在体内维持乳腺癌生长和转移
2.6.1 BAP31影响乳腺癌原位肿瘤生长
2.6.2 BAP31影响乳腺癌原位组织浸润和远端转移能力
2.7 结果与讨论
第3章 材料与方法
3.1 临床组织样本的收集分析
3.2 细胞培养
3.3 质粒载体的构建
3.3.1 BAP31和SERCA2过表达载体的构建
3.3.2 BAP31和SERCA2敲低载体的构建
3.3.3 带Flag标签的BAP31截短蛋白载体构建
3.4 慢病毒的包装和稳转细胞的建立
3.5 细胞和组织总RNA的抽提和检测
3.5.1 病理样本的总RNA抽提
3.5.2 细胞的总RNA抽提
3.5.3 cDNA的合成和实时荧光定量PCR
3.6 细胞总蛋白的提取和检测
3.7 细胞功能检测实验
3.7.1 细胞活力和克隆形成能力测定
3.7.2 细胞周期的检测
3.7.3 细胞凋亡和失巢凋亡的检测
3.7.4 细胞软琼脂非锚定生长能力检测
3.7.5 细胞基质胶培养实验
3.7.6 细胞迁移和侵袭能力检测
3.7.7 细胞划痕愈合能力检测
3.7.8 细胞分散实验
3.8 蛋白质免疫沉淀实验
3.9 银染实验
3.10 免疫荧光实验
3.11 细胞内质网钙离子外流的检测
3.12 肿瘤切片的免疫组织化学染色
3.13 小鼠原位脂肪垫荷瘤实验
3.14 尾静脉小鼠肿瘤肺转移实验
3.15 生物信息学分析及统计
参考文献
附录A 实验试剂
附录B 主要实验仪器设备
附录C 实验室常规试剂溶液配制
附录D 常规实验方法
细胞DNA抽提
Trizol法抽提RNA
去除RNA中的DNA残留
逆转录PCR (RT-PCR)
实时定量PCR
PCR片段扩增
PCR产物及凝胶回收
酶切反应
连接反应
感受态细胞的制备
细菌转化
质粒小量抽提
质粒中量抽提
蛋白浓度测定
Western Blot
蛋白抽提
MTT细胞活力测定
细胞计数实验
细胞贴壁培养克隆形成实验
碘化丙啶(PI)法检测细胞周期
Transwell迁移和侵袭实验
划痕愈合实验
细胞克隆分散实验
Annexin V/PI双染色流式检测细胞凋亡实验
免疫荧光技术
免疫组织化学染色
组织切片TUNEL实验
附录E 引物序列和抗体信息
致谢
在读期间发表的学术论文与取得的研究成果
本文编号：3926774
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