稻瘟病菌胁迫下水稻热激蛋白质与异三聚体G蛋白质的作用机理研究

发布时间：2017-03-28 07:07

  本文关键词：稻瘟病菌胁迫下水稻热激蛋白质与异三聚体G蛋白质的作用机理研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：水稻稻瘟病由稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)侵染引起,是水稻最严重的病害之一,可造成水稻的大幅度减产,甚至颗粒无收。水稻稻瘟病分布十分广泛,世界各地均有发生,我国作为重要的水稻产区,也深受其害。探明水稻对稻瘟病菌侵染的感知、传导与响应的分子机制,指导培育出抗稻瘟病的水稻新品种,是避免水稻因稻瘟病而大幅减产的重要研究内容。前人研究表明,热激蛋白质(Heat shock protein, Hsp)与异三聚体G蛋白质(Heterotrimeric G-protein)是生物体内信号传导通路的关键蛋白质。但目前对异三聚体G蛋白质和Hsp在水稻应对稻瘟病菌胁迫中的作用机制研究尚不多见。本文以水稻品种日本晴(Nipponbare)为试验材料,首先应用生物信息学方法、2-DE、质谱技术、基因芯片分析技术以及qRT-PCR技术分析稻瘟病菌生理小种GUY 11侵染胁迫后2d、4d和6d下水稻叶片异三聚体G蛋白质和热激蛋白质的表达差异；然后,通过1DNative-PAGE、2D SDS-PAGE和Pull-down等技术,分析稻瘟病菌胁迫下与水稻的互作蛋白质,结果如下。1、从NCBI数据库中获取前人已克隆的稻瘟病菌抗性基因序列,通过BLAST和BWA软件查找各抗性基因在日本晴基因组的位置及其SNP位点,发现与GUY11感病的水稻品种C039相比,在日本晴基因组中定位到Pish, Pi-d3, Pi-56, Pi-21和Pi-37抗性基因位点及SNP。2、应用2-DE技术和MALDI-TOF-TOF-MS质谱技术分析稻瘟菌侵染2d、4d和6d下水稻叶片蛋白质的表达差异。鉴定出了22个差异表达的蛋白质,其中17个蛋白质的表达量在三个胁迫时期均上调,其他5个蛋白质的表达量在3个胁迫时期均下调。根据质谱结果和GO分析结果,这22个差异蛋白质可分为抗逆相关蛋白质、光合作用相关蛋白质和蛋白质合成相关蛋白质三类。其中,在抗逆相关蛋白质中发现了6个热激蛋白质,分别是Hsp90、 Hsp70、Cpn60、Hsp17.9A、Hsp17.4和Hsp16.9A,均为上调表达,表明热激蛋白质在水稻应对稻瘟病菌胁迫中具有重要作用。3、从NCBI数据库下载获得水稻在稻瘟病菌生理小种GUY11胁迫48h下的基因芯片表达谱数据(GSE9450),应用工具GEO2R分析基因的差异表达。发现其中有4个差异表达的基因与上述差异表达蛋白质相匹配,且在抗病水稻品种中的表达量高于感病品种。其中,有两个蛋白质是热激蛋白,分别是Hsp17.9A和Cpn60,表明热激蛋白表达量的高低可能与不同水稻品种的不同抗稻瘟能力有关。4、qRT-PCR的结果发现,G蛋白各亚基在稻瘟病菌侵染下的表达量大多受到抑制,但是在不同的时间点,总有不同的G蛋白亚基表达量不再呈现下调。结果表明,尽管稻瘟病菌能抑制G蛋白各亚基的表达,但是水稻可能在稻瘟病菌的抑制下仍能通过调控不同的G蛋白亚基的表达来向下游通路传递胁迫信号。5、Native-PAGE发现了3个蛋白质复合体,包含4个能量代谢相关蛋白质和2个抗逆胁迫相关蛋白,并通过GO分析推测这些蛋白质体内互作的可能。His Pull-down结果检测出了5个可能与Hsp17.9A蛋白互作的蛋白质。推测在稻瘟病菌胁迫下,Hsp17.9A表达量上调,并通过蛋白质互作将胁迫信号传递给下游互作蛋白,调控水稻体内的氨基酸代谢、碳代谢、蛋白质合成与病原菌防御过程,以应对稻瘟菌的胁迫。本文研究结果揭示了在稻瘟菌胁迫下水稻热激蛋白质和异三聚体G蛋白的作用机制,尤其是从蛋白质表达、基因表达和蛋白质互作的角度,阐明了Hsp17.9A在应对稻瘟病菌胁迫下的作用方式。这些研究结果与本实验室前期对非生物胁迫下热激蛋白质的作用机制研究结果相一致,为下一步应用突变体技术深入开展Hsp17.9A的功能研究奠定了基础。
【关键词】：水稻 稻瘟病菌 热激蛋白质 异三聚体G蛋白质 作用机理
【学位授予单位】：福建农林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S435.111.41
【目录】：

• 摘要7-9
• Abstract9-11
• 1 引言11-22
• 1.1 热激蛋白质12-15
• 1.1.1 热激蛋白质概述12-13
• 1.1.2 水稻热激蛋白质研究进展13-15
• 1.2 异三聚体G蛋白质15-17
• 1.2.1 异三聚体G蛋白质概述15
• 1.2.2 植物中的G蛋白质研究进展15-16
• 1.2.3 水稻异三聚体G蛋白质研究进展16-17
• 1.3 蛋白质相互作用研究概况17-21
• 1.3.1 免疫共沉淀18
• 1.3.2 蛋白质亲和层析18
• 1.3.3 酵母双杂交18-19
• 1.3.4 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳19
• 1.3.5 蛋白质芯片技术19-20
• 1.3.6 Pull-down技术20-21
• 1.3.7 Far-Western blotting技术21
• 1.3.8 双分子荧光互补技术21
• 1.4 本课题研究思路21-22
• 2 材料与方法22-34
• 2.1 材料22
• 2.2 材料处理22-23
• 2.3 稻瘟病主效抗性基因序列差异分析23
• 2.4 稻瘟病菌胁迫下水稻叶片差异表达蛋白质分析23-27
• 2.4.1 双向电泳分析23-26
• 2.4.2 差异蛋白质表达图谱的建立及差异点的鉴定26
• 2.4.3 凝胶蛋白质点的酶解26
• 2.4.4 MALDI-TOF/MS和MALDI-TOF/TOF/MS26
• 2.4.5 Gene Ontology(Go)分析26-27
• 2.4.6 共表达网络构建及功能模块鉴定27
• 2.5 稻瘟病菌胁迫下水稻叶片差异表达基因分析27-28
• 2.5.1 基因芯片数据的获取与分析27
• 2.5.2 Real time qPCR27-28
• 2.6 稻瘟病菌胁迫下水稻叶片互作蛋白质分析28-34
• 2.6.1 非变性凝胶的双向电泳28-29
• 2.6.2 Pull down分析29-34
• 3 结果与分析34-53
• 3.1 稻瘟病菌侵染下水稻的发病症状34
• 3.2 日本晴水稻应对稻瘟病菌胁迫的主效抗性基因分析34-35
• 3.3 稻瘟病菌侵染胁迫下日本晴水稻叶片差异表达蛋白质的鉴定与分析35-43
• 3.4 日本晴水稻应对稻瘟病菌胁迫的蛋白质共表达分析43
• 3.5 稻瘟病菌胁迫下水稻基因的差异表达43-44
• 3.6 Real time qPCR对G蛋白质的差异表达分析44-45
• 3.7 稻瘟病菌侵染胁迫下日本晴水稻叶片互作蛋白质分析45-53
• 3.7.1 1-D Native-PAGE/2-D SDS-PAGE分离45-50
• 3.7.2 His Pull-down分析50-53
• 4 讨论53-58
• 4.1 日本晴水稻应对稻瘟病菌胁迫的主效抗性基因分析53-54
• 4.2 稻瘟病菌侵染胁迫下日本晴水稻叶片差异表达蛋白质54-56
• 4.2.1 抗逆胁迫相关蛋白质54-55
• 4.2.2 光合作用相关蛋白质55-56
• 4.2.3 蛋白质合成相关蛋白质56
• 4.2.4 小结56
• 4.3 稻瘟病菌侵染胁迫下日本晴水稻叶片差异表达基因56-57
• 4.4 稻瘟病菌侵染胁迫下日本晴水稻叶片互作蛋白质分析57-58
• 5 小结58-60
• 参考文献60-69
• 致谢69

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