昆虫病原线虫共生菌中Ⅲ型分泌系统的功能研究
发布时间：2021-11-12 18:50
昆虫病原线虫共生菌是一类与线虫共生的革兰氏阴性细菌,包括发光杆菌属（Photorhabdus spp.）和致病杆菌属（Xenorhabdus spp.）。在自然界中,这类细菌主要存在于线虫体内,可以分泌多种毒力因子帮助线虫杀死昆虫。研究表明,III型分泌系统（T3SS）是病原菌分泌毒力因子的关键分泌系统,而T3SS在昆虫病原线虫共生菌中的功能机制尚未阐明。前期研究中,课题组从Photorhabdus luminescens TT01菌株中克隆了T3SS合成基因簇,并将接合转移元件重组至重组质粒中,为在Xenorhabdus stockiae HNxs01中异源表达T3SS奠定了基础。本研究通过接合转移的方式将携带P.luminescens TT01菌株T3SS合成基因簇的重组质粒转入HNxs01菌株中,全基因组扫描表明:P.luminescens TT01菌株T3SS合成基因簇成功整合至HNxs01菌株染色体上。与野生型菌株相比,重组菌株HNxs01-T3SS对枞色卷蛾中肠细胞CF-203的侵袭能力...
【文章来源】：湖南师范大学湖南省 211工程院校
【文章页数】：74 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
XopA蛋白与副溶血弧菌中VopA效应蛋白相似性分析
硕士学位论文32第三章结果和分析3.1携带T3SS基因簇的重组菌株的构建及鉴定将从PhotorhabdusluminescensTT01中克隆到的T3SS合成基因簇通过接合转移的方式转移到XenorhabdusstockiaeHN_xs01中，通过PCR扩增T3SS基因簇相应目的条带进行检测。以接合子的基因组为模板，进行PCR扩增，获得目的片段大小分别为1010bp，876bp，793bp（图3-1），与预期一致，表明携带T3SS合成基因簇的重组菌株构建成功。同时，通过全基因组扫描，证实T3SS合成基因簇成功整合到HN_xs01染色体上。图3-1PCR扩增T3SS基因簇片段Fig3-1AmplificationproductsofT3SSgeneclusterM:DL2000;1-3:以T3SS-1-F/T3SS-1-R为引物;4-6:以T3SS-2-F/T3SS-2-R为引物;7-9:以T3SS-3-F/T3SS-3-R为引物;10:以srfA-F/srfA-R为引物3.2重组菌株的杀虫活性分析取不同浓度的重组菌株HN_xs01-T3SS和野生型菌株HN_xs01对棉铃虫四龄幼虫进行血腔注射，注射重组菌株和野生型菌株72h后，观察棉铃虫四龄幼虫的生长状况。注射重组菌株和野生型菌株后，部分棉铃虫四龄幼虫均出现体表黑化，虫体生长受到抑制的现象，且最终受试昆虫死亡（图3-2A）；但在不同的菌株注射浓度下，注射重组菌株的棉铃虫四龄幼虫的死亡率显著高于注射野生型菌株组（图3-2B），说明T3SS增强了HN_xs01菌株的杀虫活性。
昆虫病原线虫共生菌中III型分泌系统的功能研究33图3-2重组菌株和野生型菌株对棉铃虫四龄幼虫的注射毒力Fig3-2TheinjectabletoxicityagainstH.armigerafourthinstarlarvaA:棉铃虫四龄幼虫的形态变化；B:72h后棉铃虫四龄幼虫的死亡率(n=3,**p<0.01,***p<0.001)3.3重组菌株对昆虫细胞的侵袭测定将含mCherry标签的质粒转入重组菌株和野生型菌株中，在倒置荧光显微镜下观察重组菌株和野生型菌株均携带红色荧光，说明质粒成功转入（图3-3）。将重组菌株和野生型菌株与CF-203细胞共孵育2h后，在激光共聚焦显微镜下观察重组菌株和野生型菌株均能侵入CF-203细胞（图3-4）。在不同的MOI（10，20，30）下，将细菌与CF-203细胞共孵育2h后，检测侵入细胞中的细胞数，结果显示：在不同的感染复数下，重组菌株侵入CF-203细胞的细菌数均高于野生型菌株组，且MOI为20时侵入细胞的细菌数量最多（表3-1和3-2），说明T3SS能提高HN_xs01的侵袭能力。图3-3红色荧光蛋白mCherry标记HN_xs01和HN_xs01-T3SSFig3-3mCherrylabeledHN_xs01andHN_xs01-T3SSAB
【参考文献】：
期刊论文
[1]革兰阴性菌分泌系统及其分泌产物研究进展[J]. 余乐正,柳凤娟,鄢南南,程旭,李益洲,郭延芝. 动物医学进展. 2017(08)
[2]从嗜线虫杆菌分离的吲哚衍生物抗肿瘤活性的研究[J]. 吕秋军,简恒,刘卫京,杨秀芬,温利青,陈媛媛,郭绍明,曲艳燕,董俊兴. 中国新药杂志. 2002(11)
本文编号：3491472
【文章来源】：湖南师范大学湖南省 211工程院校
【文章页数】：74 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
XopA蛋白与副溶血弧菌中VopA效应蛋白相似性分析
硕士学位论文32第三章结果和分析3.1携带T3SS基因簇的重组菌株的构建及鉴定将从PhotorhabdusluminescensTT01中克隆到的T3SS合成基因簇通过接合转移的方式转移到XenorhabdusstockiaeHN_xs01中，通过PCR扩增T3SS基因簇相应目的条带进行检测。以接合子的基因组为模板，进行PCR扩增，获得目的片段大小分别为1010bp，876bp，793bp（图3-1），与预期一致，表明携带T3SS合成基因簇的重组菌株构建成功。同时，通过全基因组扫描，证实T3SS合成基因簇成功整合到HN_xs01染色体上。图3-1PCR扩增T3SS基因簇片段Fig3-1AmplificationproductsofT3SSgeneclusterM:DL2000;1-3:以T3SS-1-F/T3SS-1-R为引物;4-6:以T3SS-2-F/T3SS-2-R为引物;7-9:以T3SS-3-F/T3SS-3-R为引物;10:以srfA-F/srfA-R为引物3.2重组菌株的杀虫活性分析取不同浓度的重组菌株HN_xs01-T3SS和野生型菌株HN_xs01对棉铃虫四龄幼虫进行血腔注射，注射重组菌株和野生型菌株72h后，观察棉铃虫四龄幼虫的生长状况。注射重组菌株和野生型菌株后，部分棉铃虫四龄幼虫均出现体表黑化，虫体生长受到抑制的现象，且最终受试昆虫死亡（图3-2A）；但在不同的菌株注射浓度下，注射重组菌株的棉铃虫四龄幼虫的死亡率显著高于注射野生型菌株组（图3-2B），说明T3SS增强了HN_xs01菌株的杀虫活性。
昆虫病原线虫共生菌中III型分泌系统的功能研究33图3-2重组菌株和野生型菌株对棉铃虫四龄幼虫的注射毒力Fig3-2TheinjectabletoxicityagainstH.armigerafourthinstarlarvaA:棉铃虫四龄幼虫的形态变化；B:72h后棉铃虫四龄幼虫的死亡率(n=3,**p<0.01,***p<0.001)3.3重组菌株对昆虫细胞的侵袭测定将含mCherry标签的质粒转入重组菌株和野生型菌株中，在倒置荧光显微镜下观察重组菌株和野生型菌株均携带红色荧光，说明质粒成功转入（图3-3）。将重组菌株和野生型菌株与CF-203细胞共孵育2h后，在激光共聚焦显微镜下观察重组菌株和野生型菌株均能侵入CF-203细胞（图3-4）。在不同的MOI（10，20，30）下，将细菌与CF-203细胞共孵育2h后，检测侵入细胞中的细胞数，结果显示：在不同的感染复数下，重组菌株侵入CF-203细胞的细菌数均高于野生型菌株组，且MOI为20时侵入细胞的细菌数量最多（表3-1和3-2），说明T3SS能提高HN_xs01的侵袭能力。图3-3红色荧光蛋白mCherry标记HN_xs01和HN_xs01-T3SSFig3-3mCherrylabeledHN_xs01andHN_xs01-T3SSAB
【参考文献】：
期刊论文
[1]革兰阴性菌分泌系统及其分泌产物研究进展[J]. 余乐正,柳凤娟,鄢南南,程旭,李益洲,郭延芝. 动物医学进展. 2017(08)
[2]从嗜线虫杆菌分离的吲哚衍生物抗肿瘤活性的研究[J]. 吕秋军,简恒,刘卫京,杨秀芬,温利青,陈媛媛,郭绍明,曲艳燕,董俊兴. 中国新药杂志. 2002(11)
本文编号：3491472
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