禾谷镰刀菌FgCNA和FgCNB基因沉默载体的构建及其对禾谷镰刀菌生理功能影响的研究

发布时间：2022-08-11 17:31

　　小麦赤霉病（Fusarium Head Blight,FHB）是一种流行范围广,危害力大的真菌病害,控制小麦赤霉病的发病不仅能够保障农作物的健康生长以及产量,而且对于食品营养与安全具有重要的意义。RNA干扰（RNA interference,RNAi）是一种具有广阔前景的基因编辑技术,可以对无法通过基因敲除的必需基因进行基因沉默,即通过对目的基因进行干扰,使该基因的表达量在一定程度上被抑制,从而达到减弱基因表达的效果,减轻病害和产毒。本研究首先通过基因敲除验证了禾谷镰刀菌钙调神经磷酸酶基因CNA和CNB为必需基因,然后构建了FgCNA和FgCNB基因沉默载体,研究了其对禾谷镰刀菌生理功能的影响,并且通过体外合成双链RNA,喷施大麦叶片验证了其抑制镰刀菌侵染的效果,为小麦赤霉病的高效、绿色安全防控奠定了基础。主要研究结果如下:（1）通过基因敲除技术及原生质体转化无法获得敲除突变体,利用PCR技术验证了所有转化体均为异位插入突变体,证明FgCNA和FgCNB基因为敲除致死基因。（2）通过构建沉默载体,利用聚乙二醇（PEG）介导的原生质体转化方法,将沉默载体转化进禾谷镰刀菌PH-1中,筛选获... 

【文章页数】：75 页

【学位级别】：硕士

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中文摘要
Abstract
1 前言
    1.1 RNA干扰
    1.2 基因沉默技术在治理小麦赤霉病中的最新研究进展
        1.2.1 小麦赤霉病
        1.2.2 禾谷镰刀菌及其侵染过程简介
        1.2.3 FHB的防治策略
        1.2.4 RNAi与寄主诱导的基因沉默
        1.2.5 HIGS与禾谷镰刀菌引起的赤霉病
        1.2.6 优势与挑战
        1.2.7 RNAi的应用
    1.3 钙调神经磷酸酶
        1.3.1 钙调神经磷酸酶简介
        1.3.2 钙调神经磷酸酶的作用
    1.4 RNA干扰的应用前景
    1.5 研究目的与意义
    1.6 研究内容
2 材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 实验菌株
        2.1.2 实验品种
        2.1.3 载体与菌株
        2.1.4 实验引物
        2.1.5 实验试剂
        2.1.6 培养基及试剂的配制
        2.1.7 主要仪器设备
    2.2 实验方法
        2.2.1 基因敲除
            2.2.1.1 菌株的活化
            2.2.1.2 基因组DNA的提取
            2.2.1.3 用于FgCNA和 FgCNB基因敲除的线性DNA片段的构建
            2.2.1.4 PCR产物纯化
            2.2.1.5 胶回收
            2.2.1.6 PEG介导的原生质体转化
            2.2.1.7 PCR验证
        2.2.2 基因沉默
            2.2.2.1 沉默载体的构建
            2.2.2.2 原生质体转化
        2.2.3 荧光定量PCR验证基因表达量
            2.2.3.1 RNA的提取
            2.2.3.2 反转录
            2.2.3.3 PCR
        2.2.4 沉默菌株的表型测定
            2.2.4.1 生长速度的测定
            2.2.4.2 产孢能力的测定
            2.2.4.3 孢子长度及隔膜数目的测定
            2.2.4.4 耐盐胁迫
            2.2.4.5 耐碱胁迫
            2.2.4.6 产毒能力的测定
            2.2.4.7 致病力的测定
        2.2.5应用实验
            2.2.5.1 体外合成RNA
            2.2.5.2 双链RNA喷施抑制镰刀菌侵染试验
3 结果与分析
    3.1 基因敲除
        3.1.1 用于FgCNA和 FgCNB基因敲除的线性DNA片段的构建
        3.1.2 基因敲除和PCR验证
    3.2 基因沉默
        3.2.1 PCR扩增目的基因片段验证
        3.2.2 酶切与连接
        3.2.3 反向片段的插入验证
    3.3 PEG介导的原生质体转化获得沉默转化子
    3.4 荧光定量PCR验证基因表达量
    3.5 沉默菌株的生理功能测定
        3.5.1 生长速度的测定
        3.5.2 产孢能力的测定
        3.5.3 孢子长度及隔膜数目的测定
        3.5.4 耐盐胁迫
        3.5.5 耐碱胁迫
        3.5.6 产毒能力的测定
        3.5.7 致病力的测定
        3.5.8 应用实验
            3.5.8.1 扩增模板基因片段
            3.5.8.2 合成双链RNA和喷施抑制镰刀菌侵染试验
4 讨论
5 结论
参考文献
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]小麦赤霉病的发生及综合防控[J]. 闫向泉,朱伟,孟自力.  现代农业科技. 2019(24)
[2]核酸农药——极具潜力的新型植物保护产品[J]. 王治文,高翔,马德君,钟珊,刘西莉,席真.  农药学学报. 2019(Z1)
[3]小麦赤霉病防治研究进展[J]. 邢立志,张鑫.  安徽农学通报. 2019(18)
[4]小麦病害症状识别与药剂防治[J]. 孙宏琳.  吉林农业. 2019(11)
[5]发展基因沉默技术,控制作物土传真菌病害[J]. 郭惠珊,高峰,赵建华,张博森.  中国科学院院刊. 2017(08)
[6]寄主诱导的基因沉默提高植物真菌病害抗性研究进展[J]. 程伟,李和平,何水林,廖玉才.  作物学报. 2017(08)
[7]小麦中镰刀菌毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇污染现状与防控研究进展[J]. 史建荣,刘馨,仇剑波,祭芳,徐剑宏,董飞,殷宪超,冉军舰.  中国农业科学. 2014(18)
[8]抗纹枯病、赤霉病的转TaPIEP1基因小麦的分子鉴定与选育[J]. 刘欣,蔡士宾,张伯桥,周淼平,路妍,吴继中,杜丽璞,李斯深,臧淑江,张增艳.  作物学报. 2011(07)
[9]RNA干扰的研究进展及应用[J]. 李方华,侯玲玲,苏晓华,郑扬,庞全海,关伟军,马月辉.  生物技术通讯. 2010(05)
[10]转几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶双价基因小麦的获得和鉴定[J]. 叶兴国,程红梅,徐惠君,杜丽璞,陆维忠,黄益洪.  作物学报. 2005(05)



本文编号：3675086