利用CRISPR/CAS9技术创建甘蓝型油菜多室突变体

发布时间：2023-02-01 14:56

　　利用CRISPR/Cas9系统进行定向基因编辑,创造新型种质资源已经在多种重要作物中得到成功的运用。在甘蓝型油菜中,多室性状能够增加每角果粒数从而达到增产目的,但是在自然条件下还没有发现多室突变体。根据模式植物拟南芥中已发现的多室角果形成的相关途径和基因。我们挑选了甘蓝型油菜中的Bna CLV1、Bna CLV2、Bna CLV3和Bna RPK2作为甘蓝型油菜的多室候选靶基因,设计它们的CRISPR/Cas9编辑载体,通过农杆菌介导的遗传转化创建这些候选基因的突变体。在此基础上,一方面可以确定这些基因功能,另一方面也可以创建多室突变体,为油菜的高产育种提供新的种质资源。主要结果如下:1.生物信息学分析表明,甘蓝型油菜中Bna CLV1、Bna CLV2、Bna CLV3和Bna RPK2基因的结构和拟南芥的同源基因基本相同。根据这些基因的结构,我们针对各个候选基因设计了2-4个靶位点,构建了它们的多靶点CRISPR/Cas9载体,利用农杆菌介导的下胚轴遗传转化法分别获得了119、40、319和108株Bna CLV1、Bna CLV2、Bna CLV3和Bna RPK2的T0代转基因... 

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【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略词表
1 前言
    1.1 多室油菜的研究进展
        1.1.1 多室油菜的种类及表型特征
        1.1.2 多室油菜的遗传及其基因定位
        1.1.3 模式植物拟南芥中多室性状的分子调控机理
    1.2 基因组编辑技术的研究进展
        1.2.1 主要基因编辑技术简介
        1.2.2 细菌中CRISPR/Cas免疫系统的简介
            1.2.2.1 CRISPR/Cas基因座的结构
            1.2.2.2 CRISPR/Cas系统的分类
            1.2.2.3 CRISPR/Cas免疫系统的工作原理
        1.2.3 人工合成的CRISPR/Cas9系统
            1.2.3.1 Cas9蛋白
            1.2.3.2 导向RNA
            1.2.3.3 PAM元件
            1.2.3.4 CRISPR/Cas9的工作原理
        1.2.4 CRISPR/Cas9与其他基因编辑技术的比较
        1.2.5 CRISPR/Cas9编辑的检测方法
        1.2.6 CRISPR/Cas9基因编辑的类型和突变效率
        1.2.7 CRISPR/Cas9基因编辑技术在植物中的应用
    1.3 本研究的目的与意义
2 材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 转化载体
        2.1.3 主要试剂
        2.1.4 主要试剂的配方
            2.1.4.1 油菜遗传转化的培养基
            2.1.4.2 DNA提取相关试剂
            2.1.4.3 非变性PAGE胶相关试剂
    2.2 实验方法
        2.2.1 多靶点CRISPR/Cas9载体的构建
        2.2.2 农杆菌介导的遗传转化与阳性鉴定
            2.2.2.1 农杆菌介导的油菜下胚轴遗传转化
            2.2.2.2 转基因植株的阳性鉴定
        2.2.3 转基因阳性植株的编辑检测和测序
            2.2.3.1 基于PAGE的编辑检测
            2.2.3.2 PCR产物测序
            2.2.3.3 PCR产物克隆测序
        2.2.4 转基因油菜的种植
        2.2.5 多室性状考察
3 实验结果
    3.1 多室候选基因结构分析
    3.2 多靶点CRISPR/Cas9载体的构建
    3.3 CRISPR/Cas9转基因植株的阳性鉴定结果
    3.4 甘蓝型油菜中CRISPR/Cas9的编辑效率
    3.5 突变的类型
    3.6 突变的遗传
    3.7 突变表型
4 讨论
    4.1 多靶点CRISPR-Cas9系统在油菜中的运用
    4.2 多靶点CRISPR-Cas9系统在甘蓝型油菜中的突变特点
    4.3 甘蓝型油菜的多室基因
    4.4 存在问题
参考文献
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]拟南芥茎尖干细胞调控机制的研究进展[J]. 崔玉超,陈亮.  厦门大学学报(自然科学版). 2016(06)
[2]芥菜型油菜多室基因Bjmc2的精细定位[J]. 王刚,张向向,徐平,吕泽文,文静,易斌,马朝芝,涂金星,傅廷栋,沈金雄.  作物学报. 2016(12)
[3]甘蓝型油菜三棱角自交群体的角果性状[J]. 朱彦涛,田建华.  中国油料作物学报. 2015(05)
[4]芥菜型油菜多室角果的解剖特征及遗传分析[J]. 吕泽文,徐平,张向向,文静,易斌,马朝芝,涂金星,傅廷栋,沈金雄.  中国油料作物学报. 2012(05)
[5]我国油菜产业发展的历史回顾与展望[J]. 王汉中.  中国油料作物学报. 2010(02)
[6]甘蓝型三棱角油菜新材料的遗传与选育研究初报[J]. 朱彦涛.  西北农业学报. 2005(01)
[7]多心皮油菜的植物学特征及意义[J]. 代秉勋,李加纳,沈显生,戴秉益,王平,朱祥文.  作物研究. 2004(01)
[8]芥菜型油菜多室性状的遗传研究[J]. 赵洪朝,杜德志,刘青元,余青兰,王瑞生.  西北农林科技大学学报(自然科学版). 2003(06)
[9]白菜型油菜角果多室性状的遗传及解剖学研究[J]. 何余堂,龙卫华,胡进平,傅廷栋,李殿荣,陈宝元,涂金星.  中国油料作物学报. 2003(01)
[10]我国油菜育种研究的进展[J]. 刘后利.  中国农学通报. 1988(05)

硕士论文
[1]白菜型油菜多室基因BrCLV3的功能研究[D]. 武语笛.华中农业大学 2015
[2]芥菜型油菜多室性状的遗传表现及其与甘蓝型油菜的种间远缘杂交[D]. 赵洪朝.西北农林科技大学 2003



本文编号：3734257