细粒棘球绦虫TSP14以及TSP33基因的克

发布时间：2023-03-11 17:22

　　包虫病是由中绦期细粒棘球绦虫引起的,该病在全球范围内均有分布,我国是该病高发的国家和地区之一。该病危害性大,患者10年病死率高达94%。防控措施以吡喹酮犬犬投药月月驱虫为主,尽管有效,但是在基层难以长期坚持,而且流浪狗难以管理;针对中间宿主的EG95疫苗对移行期内的病原防控有效,但是终末宿主与中间宿主数量比达到45:1,防控成本很高;因此,建立针对终末宿主有效的免疫预防方法是防控该病的一致研究方向。国内外研究表明,四跨膜蛋白家族(TSP)在寄生虫的研究中具有很好的免疫原价值,因此,本试验针对Eg-TSP14和Eg-TSP33进行了克隆、原核表达以及免疫原性初步研究,以期为Eg-TSP14和Eg-TSP33是否具有作为疫苗候选抗原的潜力提供理论基础。目的:克隆Eg-TSP14以及Eg-TSP33基因,并构建重组pET-32a-TSP14以及pET-32a-TSP33质粒,转化至大肠杆菌中进行原核表达,并将重组蛋白免疫小鼠对其免疫原性进行初步研究。方法:(1)以细粒棘球绦虫成虫、原头蚴和包囊壁的cDNA为模板,利用荧光定量PCR技术进行扩增,分析两个基因在虫体不同发育阶段的差异表达情况。(...

【文章页数】：70 页

【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
缩略词表
引言
第一章 文献综述
    1 E.granulosus形态学特点
    2 E.g.生活史
    3 流行病学
        3.1 流行状况
        3.2 流行因素
    4 诊断方法
        4.1 常规诊断方法
        4.2 血清学诊断
    5 细粒棘球蚴病防治策略
        5.1 EG95
        5.2 EgM蛋白家族
        5.3 EgA31
        5.4 Eg14-3-3 蛋白
    6 四跨膜蛋白
        6.1 四跨膜蛋白的生物功能
        6.2 四跨膜蛋白在寄生虫中的研究进展
第二章 试验部分
    试验一 细粒棘球绦虫TSP14、TSP33 基因的克隆、序列分析及不同发育阶段表达分析
        1 材料
            1.1 细粒棘球蚴、包囊壁和成虫
            1.2 主要仪器设备
            1.3 主要试剂
        2 方法
            2.1 总RNA提取及反转录
            2.2 引物设计与合成
            2.3 Eg-TSP14 以及Eg-TSP33 基因的扩增
            2.4 基因扩增产物的回收
            2.5 载体的连接
            2.6 连接产物的转化
            2.7 菌液PCR
            2.8 Eg-TSP14 以及Eg-TSP33生物信息学分析
            2.9 Eg-TSP14 以及Eg-TSP33实时荧光定量PCR检测
        3 结果
            3.1 Eg-TSP14 以及Eg-TSP33 基因的克隆
            3.2 Eg-TSP14 以及Eg-TSP33 基因的序列分析
            3.3 Eg-TSP14 以及Eg-TSP33二级结构和三级结构
            3.4 Eg-TSP14 以及Eg-TSP33 结构域分析
            3.5 B细胞表位预测
            3.6 同源序列比对
            3.7 Eg-TSP14 以及Eg-TSP33 RT-PCR检测结果
        4 讨论
        5 小结
    试验二 细粒棘球绦虫TSP14 以及TSP33 非跨膜区的克隆及原核表达
        1 材料
            1.1 cDNA
            1.2 主要仪器设备
            1.3 主要试剂与耗材
            1.4 主要溶液配制
        2 方法
            2.1 总RNA提取
            2.2 引物设计
            2.3 Eg-TSP14 以及Eg-TSP33 非跨膜区片段的克隆
            2.4 Eg-TSP14 以及Eg-TSP33 非跨膜区片段的原核表达
        3 结果
            3.1 Eg-TSP14 以及Eg-TSP33 非跨膜区片段的扩增
            3.2 重组质粒的构建及双酶切鉴定
            3.3 重组蛋白的诱导表达
            3.4 重组蛋白表达形式分析、纯化及定量
        4 讨论
        5 小结
    试验三 Eg-TSP14及Eg-TSP33 蛋白免疫原性初步探究
        1 材料
            1.1 试验材料
            1.2 主要仪器与设备
            1.3 主要试剂
            1.4 试剂的配方
        2 方法
            2.1 Eg-TSP14及Eg-TSP33 高免血清的制备
            2.2 Western Blotting
            2.3 ELISA检测免疫小鼠的血清抗体滴度
            2.4 qPCR测定细胞因子动态变化
        3 结果
            3.1 Western Blot
            3.2 间接ELISA检测免疫后小鼠抗体IgG
            3.3 免疫后小鼠细胞因子检测
        4 讨论
        5 小结
全文结论
创新点
参考文献
致谢
作者简介
附件



本文编号：3759933