肝片吸虫病诊断候选抗原的筛选和制备
发布时间：2023-03-19 17:06
肝片吸虫病是由肝片吸虫(Fascioloa hepatica,F.hepatica)寄生于人和家畜肝脏、胆管,引起肝炎、胆管炎以及全身性营养障碍的一种新兴人畜共患寄生虫病。该病严重影响了全球畜牧业的发展,也造成了极其严重的公共卫生问题,吸引了全世界的广泛关注。为了丰富和拓展肝片吸虫病的诊断靶点,突破肝片吸虫病原学诊断方法的局限性,研究更加经济、快速、特异、敏感的肝片吸虫感染病的诊断方法,本研究通过肝片吸虫噬菌体展示cDNA文库的筛选、肝片吸虫特异性抗原分子的生物信息学分析、相应抗原基因的克隆、重组质粒的构建以及重组蛋白的诱导表达与Western Blot鉴定分析等研究方法和技术对肝片吸虫病的诊断候选抗原进行了筛选和制备。结果如下:(1)通过对肝片吸虫噬菌体展示cDNA文库的筛选和分析,成功获得了38条肝片吸虫基因,包括24条为已明确的肝片吸虫蛋白基因,14条为肝片吸虫假定蛋白基因。并从中筛选了5个肝片吸虫特异性抗原基因作为肝片吸虫病诊断候选抗原用于后续探索研究:组织蛋白酶L(Cathepsin L,Cat)、假定蛋白D915000758、假定蛋白D915...
【文章页数】：79 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
项目资助基金
摘要
Abstract
第1章 文献综述
1.1 肝片吸虫及肝片吸虫病概述
1.1.1 肝片吸虫
1.1.2 肝片吸虫病的流行性
1.1.3 肝片吸虫病临床症状体征
1.1.4 肝片吸虫病的防治
1.2 肝片吸虫检测方法
1.2.1 病原学检测
1.2.2 分子生物学检测
1.2.3 免疫学检测
1.2.4 其它检查方法
1.3 肝片吸虫病诊断抗原研究进展
1.3.1 组织蛋白酶家族(CAT)
1.3.2 天冬氨酰内肽酶(LEG)
1.3.3 谷胱甘肽S-转移酶(GST)
1.3.4 脂肪酸结合蛋白(FABP)
1.3.5 鞘脂激活蛋白样蛋白家族(SAP)
1.4 本研究目的及意义
第2章 肝片吸虫诊断候选抗原的筛选
2.1 材料与方法
2.1.1 肝片吸虫噬菌体cDNA展示文库和阳性血清
2.1.2 主要试剂及耗材
2.1.3 引物
2.1.4 噬菌体展示及免疫筛选用相关试剂的配制
2.1.5 阳性噬菌体初筛
2.1.6 阳性噬菌体的复筛
2.1.7 诊断候选抗原的筛选
2.2 结果
2.2.1 阳性噬菌体初筛
2.2.2 阳性噬菌体复筛
2.2.3 阳性克隆的鉴定与分析
2.2.4 候选抗原的筛选
2.3 讨论
第3章 候选抗原蛋白分子的生物信息学分析
3.1 材料与方法
3.1.1 材料
3.1.2 生物信息学分析
3.2 结果
3.2.1 肝片吸虫组织蛋白酶L
3.2.2 假定蛋白D915000758
3.2.3 假定蛋白D915001617
3.2.4 假定蛋白D915005900
3.2.5 假定蛋白D915010969
3.3 讨论
第4章 候选抗原基因的克隆以及重组质粒的构建
4.1 材料和方法
4.1.1 主要试剂及耗材
4.1.2 相关培养基和试剂的配制
4.1.3 肝片吸虫抗原基因特异性引物的设计与合成
4.1.4 特异性抗原基因的克隆
4.1.5 重组克隆质粒的构建
4.1.6 重组表达质粒的构建
4.2 结果
4.2.1 肝片吸虫组织蛋白酶L
4.2.2 假定蛋白D915000758
4.2.3 假定蛋白D915001617
4.2.4 假定蛋白D915005900
4.2.5 假定蛋白D915010969
4.3 讨论
第5章 候选抗原的诱导表达及鉴定
5.1 材料及方法
5.1.1 仪器与试剂材料
5.1.2 相关试剂的配制
5.1.3 重组蛋白的诱导表达
5.1.4 SDS-PAGE检测重组蛋白表达
5.1.5 包涵体蛋白的纯化
5.1.6 Western-Blot分析
5.2 结果
5.2.1 融合蛋白pET-Cat L的表达与鉴定
5.2.2 融合蛋白pET-000758 的表达与鉴定
5.2.3 融合蛋白pET-001617 的表达与鉴定
5.2.4 融合蛋白pET-005900 的表达与鉴定
5.2.5 融合蛋白pET-010969 的表达与鉴定
5.3 讨论
第六章 结论与展望
6.1 结论
6.2 展望
参考文献
附录一 :中英文缩略词对照表
附录二 :作者简介
致谢
本文编号：3765627
【文章页数】：79 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
项目资助基金
摘要
Abstract
第1章 文献综述
1.1 肝片吸虫及肝片吸虫病概述
1.1.1 肝片吸虫
1.1.2 肝片吸虫病的流行性
1.1.3 肝片吸虫病临床症状体征
1.1.4 肝片吸虫病的防治
1.2 肝片吸虫检测方法
1.2.1 病原学检测
1.2.2 分子生物学检测
1.2.3 免疫学检测
1.2.4 其它检查方法
1.3 肝片吸虫病诊断抗原研究进展
1.3.1 组织蛋白酶家族(CAT)
1.3.2 天冬氨酰内肽酶(LEG)
1.3.3 谷胱甘肽S-转移酶(GST)
1.3.4 脂肪酸结合蛋白(FABP)
1.3.5 鞘脂激活蛋白样蛋白家族(SAP)
1.4 本研究目的及意义
第2章 肝片吸虫诊断候选抗原的筛选
2.1 材料与方法
2.1.1 肝片吸虫噬菌体cDNA展示文库和阳性血清
2.1.2 主要试剂及耗材
2.1.3 引物
2.1.4 噬菌体展示及免疫筛选用相关试剂的配制
2.1.5 阳性噬菌体初筛
2.1.6 阳性噬菌体的复筛
2.1.7 诊断候选抗原的筛选
2.2 结果
2.2.1 阳性噬菌体初筛
2.2.2 阳性噬菌体复筛
2.2.3 阳性克隆的鉴定与分析
2.2.4 候选抗原的筛选
2.3 讨论
第3章 候选抗原蛋白分子的生物信息学分析
3.1 材料与方法
3.1.1 材料
3.1.2 生物信息学分析
3.2 结果
3.2.1 肝片吸虫组织蛋白酶L
3.2.2 假定蛋白D915000758
3.2.3 假定蛋白D915001617
3.2.4 假定蛋白D915005900
3.2.5 假定蛋白D915010969
3.3 讨论
第4章 候选抗原基因的克隆以及重组质粒的构建
4.1 材料和方法
4.1.1 主要试剂及耗材
4.1.2 相关培养基和试剂的配制
4.1.3 肝片吸虫抗原基因特异性引物的设计与合成
4.1.4 特异性抗原基因的克隆
4.1.5 重组克隆质粒的构建
4.1.6 重组表达质粒的构建
4.2 结果
4.2.1 肝片吸虫组织蛋白酶L
4.2.2 假定蛋白D915000758
4.2.3 假定蛋白D915001617
4.2.4 假定蛋白D915005900
4.2.5 假定蛋白D915010969
4.3 讨论
第5章 候选抗原的诱导表达及鉴定
5.1 材料及方法
5.1.1 仪器与试剂材料
5.1.2 相关试剂的配制
5.1.3 重组蛋白的诱导表达
5.1.4 SDS-PAGE检测重组蛋白表达
5.1.5 包涵体蛋白的纯化
5.1.6 Western-Blot分析
5.2 结果
5.2.1 融合蛋白pET-Cat L的表达与鉴定
5.2.2 融合蛋白pET-000758 的表达与鉴定
5.2.3 融合蛋白pET-001617 的表达与鉴定
5.2.4 融合蛋白pET-005900 的表达与鉴定
5.2.5 融合蛋白pET-010969 的表达与鉴定
5.3 讨论
第六章 结论与展望
6.1 结论
6.2 展望
参考文献
附录一 :中英文缩略词对照表
附录二 :作者简介
致谢
本文编号：3765627
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