CRISPR/Cas9抑制乙肝病毒复制及其诱导病毒整合风险研究
发布时间：2021-03-23 03:52
乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染是严重的全球性公共卫生问题之一。干扰素和核苷类似物为目前临床常用的抗乙肝药物,在一定程度上能有效降低患者血清中的病毒数量,但易引起病毒耐药性突变,且难以彻底清除宿主细胞内HBV共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA,cccDNA）。而新兴的CRISPR/Cas9基因编辑技术可以对许多物种基因组进行DNA的精确编辑,这一高效、快捷的技术使得从根本上清除cccDNA成为了可能。本研究针对HBV基因组设计并构建特异性CRISPR/Cas9系统,在体外乙肝细胞模型HepG2.2.15中研究CRISPR/Cas9系统对HBV DNA复制和抗原表达影响。同时应用全基因组测序技术分析CRISPR/Cas9系统剪切cccDNA后对诱导病毒DNA整合的风险。研究首先针对HBV基因组设计并筛选靶序列,分别构建HBV特异性sgNRA重组表达载体U6-X3sgRNA和U6-17sgRNA。载体经测序鉴定后,与hCas9质粒共转染HepG2.2.15细胞,转染48h后分别应用电化学发光免疫分析法和荧光定量PC...
【文章来源】：华南理工大学广东省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：74 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
HBV基因组结构
图 1-2 HBV 生活史[8]Fig. 1-2 The lifecycle of HBV的治疗现状染患者可导致慢性乙型肝炎，如果预后不良，可进一步发展为等。因此，医学界积极开展针对 HBV 致病机理及抗病毒治疗提高临床治疗效果，从而彻底治愈乙型肝炎。上世纪九十年代N）被批准作为治疗慢性乙型肝炎药物开启了治愈乙型肝炎的年代末期拉米夫定（lamivudine，LAM）为代表的核苷类似物型肝炎的的治疗进程，随后多种治疗药物和多种治疗方法相继肝炎病毒药物主要包括干扰素和核苷类似物等[9]。
图 1-3 CRISPR/Cas 系统的结构Fig. 1-3 The structure of CRISPR/Cas system CRISPR/Cas 系统中 Cas 基因核心元件序列的不同，可将 CRISPR/CⅡ型和Ⅲ型三种不同类型。其中Ⅰ型 CRISPR/Cas 系统在细菌和古细分最为复杂，包含多个功能各不相同的 Cas 蛋白。该系统在防御外源 Cas 蛋白和成熟的 crRNA 形成 CRISPR 相关的病毒防御复合体（d complex for antivirus defense，CASCAD），CASCAD 在 crRNA 的介特异性结合，随后指导具有核酸酶和解旋酶功能的 Cas3 蛋白将靶 D。Ⅲ型 CRISPR/Cas 系统常见于古细菌，在细菌中比较少见，其作用R/Cas 系统相类似，需要多个 Cas 蛋白形成复合体参与外源核酸的降元件为 Cas10 蛋白。与上述两种系统有所不同，Ⅱ型 CRISPR/Cas 系在发挥作用时仅需要一个 Cas9 蛋白核酸酶来切割外源 DNA。目前使
【参考文献】：
期刊论文
[1]恩替卡韦治疗慢性乙肝的临床效果应用分析[J]. 樊志旭. 当代医学. 2018(04)
[2]CRISPR-Cas9系统抑制乙型肝炎病毒复制相关研究[J]. 邓万燕,孟田,钱克莉,蔡雪飞,邓海君,胡接力,黄爱龙,龙泉鑫. 重庆医科大学学报. 2017(11)
[3]乙型肝炎患者行干扰素抗病毒治疗后出现不良反应的护理分析[J]. 宋丽萍. 中国医药指南. 2017(27)
[4]核苷类药物治疗慢性乙型肝炎疗效观察[J]. 吴桂生. 北方药学. 2017(08)
[5]CRISPR/Cas9基因剪辑技术在乙型肝炎病毒感染治疗中的应用[J]. 罗英英,黄爱龙,胡接力. 重庆医科大学学报. 2017(07)
[6]恩替卡韦和干扰素序贯作用对HepG2.2.15细胞HBV DNA复制的影响[J]. 杨伟,赵超,李婧,丁扬,王雪. 胃肠病学和肝病学杂志. 2016(04)
[7]干扰素联合阿德福韦酯治疗慢性乙型肝炎的疗效分析[J]. 宛月. 中国疗养医学. 2016(01)
[8]Dual gRNAs guided CRISPR/Cas9 system inhibits hepatitis B virus replication[J]. Jie Wang,Zhong-Wei Xu,Shuang Liu,Rui-Yang Zhang,Shan-Long Ding,Xiao-Meng Xie,Lu Long,Xiang-Mei Chen,Hui Zhuang,Feng-Min Lu. World Journal of Gastroenterology. 2015(32)
[9]Novel therapeutic approaches for hepatitis B virus covalently closed circular DNA[J]. Motoko Ohno,Motoyuki Otsuka,Takahiro Kishikawa,Takeshi Yoshikawa,Akemi Takata,Kazuhiko Koike. World Journal of Gastroenterology. 2015(23)
[10]Short-and long-term outcome of interferon therapy for chronic hepatitis B infection[J]. Yasushi Seo,Yoshihiko Yano. World Journal of Gastroenterology. 2014(37)
博士论文
[1]黄芪注射液联合恩替卡韦抗乙型肝炎病毒感染机理研究[D]. 严景妍.广州中医药大学 2015
硕士论文
[1]PiggyBac介导多药物代谢酶稳定表达肝细胞系的建立[D]. 贾英.华南理工大学 2015
本文编号：3095078
【文章来源】：华南理工大学广东省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：74 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
HBV基因组结构
图 1-2 HBV 生活史[8]Fig. 1-2 The lifecycle of HBV的治疗现状染患者可导致慢性乙型肝炎，如果预后不良，可进一步发展为等。因此，医学界积极开展针对 HBV 致病机理及抗病毒治疗提高临床治疗效果，从而彻底治愈乙型肝炎。上世纪九十年代N）被批准作为治疗慢性乙型肝炎药物开启了治愈乙型肝炎的年代末期拉米夫定（lamivudine，LAM）为代表的核苷类似物型肝炎的的治疗进程，随后多种治疗药物和多种治疗方法相继肝炎病毒药物主要包括干扰素和核苷类似物等[9]。
图 1-3 CRISPR/Cas 系统的结构Fig. 1-3 The structure of CRISPR/Cas system CRISPR/Cas 系统中 Cas 基因核心元件序列的不同，可将 CRISPR/CⅡ型和Ⅲ型三种不同类型。其中Ⅰ型 CRISPR/Cas 系统在细菌和古细分最为复杂，包含多个功能各不相同的 Cas 蛋白。该系统在防御外源 Cas 蛋白和成熟的 crRNA 形成 CRISPR 相关的病毒防御复合体（d complex for antivirus defense，CASCAD），CASCAD 在 crRNA 的介特异性结合，随后指导具有核酸酶和解旋酶功能的 Cas3 蛋白将靶 D。Ⅲ型 CRISPR/Cas 系统常见于古细菌，在细菌中比较少见，其作用R/Cas 系统相类似，需要多个 Cas 蛋白形成复合体参与外源核酸的降元件为 Cas10 蛋白。与上述两种系统有所不同，Ⅱ型 CRISPR/Cas 系在发挥作用时仅需要一个 Cas9 蛋白核酸酶来切割外源 DNA。目前使
【参考文献】：
期刊论文
[1]恩替卡韦治疗慢性乙肝的临床效果应用分析[J]. 樊志旭. 当代医学. 2018(04)
[2]CRISPR-Cas9系统抑制乙型肝炎病毒复制相关研究[J]. 邓万燕,孟田,钱克莉,蔡雪飞,邓海君,胡接力,黄爱龙,龙泉鑫. 重庆医科大学学报. 2017(11)
[3]乙型肝炎患者行干扰素抗病毒治疗后出现不良反应的护理分析[J]. 宋丽萍. 中国医药指南. 2017(27)
[4]核苷类药物治疗慢性乙型肝炎疗效观察[J]. 吴桂生. 北方药学. 2017(08)
[5]CRISPR/Cas9基因剪辑技术在乙型肝炎病毒感染治疗中的应用[J]. 罗英英,黄爱龙,胡接力. 重庆医科大学学报. 2017(07)
[6]恩替卡韦和干扰素序贯作用对HepG2.2.15细胞HBV DNA复制的影响[J]. 杨伟,赵超,李婧,丁扬,王雪. 胃肠病学和肝病学杂志. 2016(04)
[7]干扰素联合阿德福韦酯治疗慢性乙型肝炎的疗效分析[J]. 宛月. 中国疗养医学. 2016(01)
[8]Dual gRNAs guided CRISPR/Cas9 system inhibits hepatitis B virus replication[J]. Jie Wang,Zhong-Wei Xu,Shuang Liu,Rui-Yang Zhang,Shan-Long Ding,Xiao-Meng Xie,Lu Long,Xiang-Mei Chen,Hui Zhuang,Feng-Min Lu. World Journal of Gastroenterology. 2015(32)
[9]Novel therapeutic approaches for hepatitis B virus covalently closed circular DNA[J]. Motoko Ohno,Motoyuki Otsuka,Takahiro Kishikawa,Takeshi Yoshikawa,Akemi Takata,Kazuhiko Koike. World Journal of Gastroenterology. 2015(23)
[10]Short-and long-term outcome of interferon therapy for chronic hepatitis B infection[J]. Yasushi Seo,Yoshihiko Yano. World Journal of Gastroenterology. 2014(37)
博士论文
[1]黄芪注射液联合恩替卡韦抗乙型肝炎病毒感染机理研究[D]. 严景妍.广州中医药大学 2015
硕士论文
[1]PiggyBac介导多药物代谢酶稳定表达肝细胞系的建立[D]. 贾英.华南理工大学 2015
本文编号：3095078
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