基于CRISPR/Cas9系统的SND1基因敲除HeLa细胞稳定株的制备与鉴定

发布时间：2021-11-18 00:14

　　研究目的:SND1,又称为p100蛋白或Tudor-SN蛋白。最初研究发现其是EB病毒细胞核抗原2（Epstein-Barr virus nuclear protein2）的共活化因子。该蛋白在各物种中分布广泛,在不同生物中具有高度的保守性,参与调控细胞的多种重要生理过程。SND1蛋白具有调节基因转录和剪接加工pre-m RNA的能力,在多种肿瘤的发生发展中起重要作用。但到目前为止,SND1蛋白参与上述肿瘤的发生、发展的具体机制还不清楚,有待于进一步研究。传统的利用si RNA干扰基因表达研究基因的方法不能在细胞中完全敲除SND1基因的转录翻译,导致SND1蛋白不能完全从细胞中去除,影响对其功能的研究。最新的第三代基因编辑系统CRISPR/Cas9技术利用序列特异性的向导RNA分子引导核酸内切酶Cas9对目标靶点的特异性结合与识别,并利用其活性中心对DNA双链进行切割,从而完成对基因组的修饰与编辑。但传统的CRISPR/Cas9技术也存在脱靶效应。而改良的CRISRP/Cas9基因编辑系统的Cas9蛋白可以被改造成为特异性的切口酶,只在特定的DNA位点造成单链切口,从而激活细胞内的同源... 

【文章来源】：天津医科大学天津市 211工程院校

【文章页数】：75 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

Cas9的结构及其对crRNA的成熟改造

结果2.1 sgRNA 靶点的选择及寡核酸链的设计采用 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/网站确定人类 SND1（NM_014390.2）的基因序列。根据文献提示[72]，使用 http://crispr.mit.edu/设计 SND1 基因 double nick的上下游 sgRNA。由于 SND1 基因第一个外显子区（expressed region 1, EXON 1）和基因编码区（Coding Sequence, CDS）的重叠区域过短，因此选取第二个外显子区进行 sgRNA 设计。sgRNA 设计原则：1）sgRNA 的 5’端第一个碱基若不是 G，则需要在前面加上一个 G；2）以 sgRNA 序列为模版，设计出其互补链；3）sgRNA 及其互补链分别添加 BbsI 的酶切位点。CRISPR/Cas9 系统工作示意图如图 5。质粒载体如图 6。设计好的 sgRNA 及其互补链如表 1。

图 6 PX462 质粒图谱及其酶切位点Fig 6 PX462 vector map and its enzyme loci 重组真核表达质粒 PX462-sgRNA 的酶切结果利用 BbsI 限制性内切酶对构建好的 PX462-sgRNA-A 和 PX462-sgRNA切。结果如图 7 ，成功构建的质粒不含有 BbsI 酶切位点，因此不能被性，而 PX462 可以被剪切成两部分。

【参考文献】：
期刊论文
[1]人类P100蛋白表达抑制稳定株的建立及其对HeLa细胞周期的影响[J]. 何津岩,葛林,邵洁,赵钢,东莉洁,方建飞,姚智,杨洁.  医学分子生物学杂志. 2008(03)
[2]INK 4家族与头颈肿瘤研究新进展[J]. 刘习强.  国外医学.口腔医学分册. 2002(01)

博士论文
[1]人类p100蛋白对HeLa细胞周期的影响及其机制研究[D]. 何津岩.天津医科大学 2008



本文编号：3501851