结核分枝杆菌Rv0217c（LipW）在胁迫应答中的功能研究
发布时间：2022-01-14 20:03
结核病是由结核分枝杆菌引起的一种传染性疾病,以肺结核最为常见。近年来,多耐药和广泛耐药结核菌的出现已经加剧了结核病的流行。这与结核分枝杆菌独特的细胞壁组成可能有直接的关系,结核分枝杆菌细胞壁中含有丰富的脂类,主要成分是分枝菌酸。在进行潜伏感染时,结核分枝杆菌主要是进行脂质代谢而非碳水化合物代谢。为了能在胞内生存,结核分枝杆菌感染巨噬细胞后,积累的脂质会以三酰甘油（TAG）的形式储存,为生长提供能源。在结核分枝杆菌的基因组中,有大约250个基因参与脂类代谢,这250个基因可以分为5个家族:Lip家族、磷脂酶家族、PE/PPE家族、β-内酰胺家族和角质酶家族。本文主要围绕结核分枝杆菌Lip家族成员—LipW（Rv0217c）进行相关功能研究。本课题主要研究结核分枝杆菌Lip家族成员之一—LipW（Rv0217c）,探究LipW蛋白在结核分枝杆菌中的生物学作用;LipW的缺失菌株抵抗胁迫环境（SDS、酸和H2O2等）的能力;LipW是否会对巨噬细胞产生免疫反应,可否作为新型的结核保护疫苗。利用以下试验方法去探究LipW蛋白的性质,（1）通过NCBI...
【文章来源】：西南大学重庆市 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：72 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
017年全球结核病发病率[3]
) 99 73 67 70 蛋白二级结构分析质的二级结构是指多肽链主链原子的局部空间分布，肽链中的主，氢键主要有 α-螺旋、β-折叠和 β-转角等。我们通过对 LipW 的析发现（图 4-1），LipW 蛋白质含有 9 个 α-螺旋和 8个 β-折叠，酸-天冬氨酸-组氨酸，位于 LipW 氨基酸序列的第 149 位、239 个氨基酸序列分别具有亲核载体、质子载体和形成依懒性电子网17c 基因体外扩增与 pET-28a-Rv0217c 阳性鉴定我们进行 PCR 扩增，以结核分枝杆菌 H37Rv 为模板，将 PCR 产糖凝胶电泳显示（图 4-2a），其 PCR 产物大小为 909 bp，与我物片段大小一致，然后将 pET-28a-Rv0217c 重组质粒转化到大肠α 中，挑取单菌落，通过菌液 PCR 验证阳性后(图 4-2b)，将提取然后送北京华大公司测序鉴定。
我们从包涵体中纯化、复性得到 LipW 蛋白。SDS-PAGE 凝胶电泳结果显示 LipW 纯化成功（图4-3b）。图 4-3 （a）通过 SDS-PAGE分析 LipW 在大肠杆菌中的表达, (b) His-tag 蛋白纯化。Figure 4-3. The expression (a) and purification (b) of His-tagged Rv0217c recombinant protein inEscherichia coli by SDS-PAGE at 37℃. (a) Lane1: protein marker; lane2: uninduced culture pellet; lane3:induced (with IPTG) culture lysis; lane4: induced (with IPTG) culture pellet; lane5: induced (with IPTG) culturesupernatant. (b) Lane1: protein marker; lane 2-5: purified Rv0217c protein.4.5 LipW 蛋白活性测定我们采用对硝基苯酚作为标准试剂，绘制了标准曲线（图 4-4b ）。将透析的蛋白进行蛋白定量，并且配制底物溶液，在本次实验中我们利用的 TIANGEN的 Bradford protein assay kit 做蛋白定量（图 4-4a），用 BSA做空白对照，最后测定 595 nm 处的吸光值。根据蛋白的浓度知道 LipW 的比活：55.3 U/mg。38 kDa
【参考文献】：
期刊论文
[1]结核分枝杆菌实验室耐药诊断技术进展[J]. 刘君,裴豪,蒯守刚,尚忠波. 现代预防医学. 2014(20)
[2]结核分枝杆菌酯酶Rv1400c原核表达及表达产物的酶活性分析[J]. 陶荣珊,李金伟,刘思国,王全凯. 吉林农业大学学报. 2014(06)
本文编号：3589126
【文章来源】：西南大学重庆市 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：72 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
017年全球结核病发病率[3]
) 99 73 67 70 蛋白二级结构分析质的二级结构是指多肽链主链原子的局部空间分布，肽链中的主，氢键主要有 α-螺旋、β-折叠和 β-转角等。我们通过对 LipW 的析发现（图 4-1），LipW 蛋白质含有 9 个 α-螺旋和 8个 β-折叠，酸-天冬氨酸-组氨酸，位于 LipW 氨基酸序列的第 149 位、239 个氨基酸序列分别具有亲核载体、质子载体和形成依懒性电子网17c 基因体外扩增与 pET-28a-Rv0217c 阳性鉴定我们进行 PCR 扩增，以结核分枝杆菌 H37Rv 为模板，将 PCR 产糖凝胶电泳显示（图 4-2a），其 PCR 产物大小为 909 bp，与我物片段大小一致，然后将 pET-28a-Rv0217c 重组质粒转化到大肠α 中，挑取单菌落，通过菌液 PCR 验证阳性后(图 4-2b)，将提取然后送北京华大公司测序鉴定。
我们从包涵体中纯化、复性得到 LipW 蛋白。SDS-PAGE 凝胶电泳结果显示 LipW 纯化成功（图4-3b）。图 4-3 （a）通过 SDS-PAGE分析 LipW 在大肠杆菌中的表达, (b) His-tag 蛋白纯化。Figure 4-3. The expression (a) and purification (b) of His-tagged Rv0217c recombinant protein inEscherichia coli by SDS-PAGE at 37℃. (a) Lane1: protein marker; lane2: uninduced culture pellet; lane3:induced (with IPTG) culture lysis; lane4: induced (with IPTG) culture pellet; lane5: induced (with IPTG) culturesupernatant. (b) Lane1: protein marker; lane 2-5: purified Rv0217c protein.4.5 LipW 蛋白活性测定我们采用对硝基苯酚作为标准试剂，绘制了标准曲线（图 4-4b ）。将透析的蛋白进行蛋白定量，并且配制底物溶液，在本次实验中我们利用的 TIANGEN的 Bradford protein assay kit 做蛋白定量（图 4-4a），用 BSA做空白对照，最后测定 595 nm 处的吸光值。根据蛋白的浓度知道 LipW 的比活：55.3 U/mg。38 kDa
【参考文献】：
期刊论文
[1]结核分枝杆菌实验室耐药诊断技术进展[J]. 刘君,裴豪,蒯守刚,尚忠波. 现代预防医学. 2014(20)
[2]结核分枝杆菌酯酶Rv1400c原核表达及表达产物的酶活性分析[J]. 陶荣珊,李金伟,刘思国,王全凯. 吉林农业大学学报. 2014(06)
本文编号：3589126
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