戊型肝炎病毒基因4型在PLC/PRF/5细胞中的培养及其特征研究

发布时间：2022-01-25 10:21

　　戊型肝炎病毒（Hepatitis E Virus,HEV）是戊型肝炎（Hepatitis E,HE）的病原体。HEV分为4个基因型,其中4型是我国流行的主要基因型。我国为HEV的流行区,HE占我国急性病毒性肝炎20%左右,病死率为1.4%-5.3%,而孕妇中的病死率可达25%,这使得HE成为一个重要的公共卫生问题。目前限制我国HEV研究的主要原因为缺乏一个高效稳定的HEV体外培养系统,虽然国外Tanaka和Shukla等分别于2007年和2011年建立了HEV的体外培养系统,但我们无法获得其毒种。本研究中,我们利用感染HEV 4型的恒河猴的粪便制备毒种,在PLC/PRF/5细胞中建立了HEV 4型的体外培养系统。通过积累经验和条件优化,提高细胞培养的效率和稳定性,并在此基础上,对HEV在细胞培养中的部分特性进行研究。取HEV 4型感染恒河猴4周后的粪便制备毒种,接种15株候选细胞株,结果显示HEV 4型仅可在PLC/PRF/5细胞中复制并释放至培养上清中。对HEV的接种时间和接种温度进行优化,接种时间为2、4、6和24小时条件下,1.0x106拷贝/mlHEV接种PLC/PRF/5细胞... 

【文章来源】：北京协和医学院北京市 211工程院校 985工程院校

【文章页数】：105 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
中文摘要
Abstract
前言
材料和试剂
    1. 材料
        1.1 恒河猴粪便
        1.2 细胞
    2. 试剂
方法
    1. 毒种的制备
    2. 细胞培养
    3. HEV接种(细胞株筛选阶段)
    4. HEV接种PLC/PRF/5细胞
    5. 含HEV培养上清浓缩和粗纯
    6. 病毒的pH3.0/pH11.0处理
    7. 病毒的热灭活处理
    8. 病毒脱脂处理
    9. 含病毒上清电镜观察用铜网的制备
    10. 含病毒细胞电镜观察用样品的制备
    11. 细胞免疫荧光染色
    12. pORF2抗原检测
    13. 抗HEV全抗体检测
    14. 抗HEV IgG抗体检测
    15. 抗HEV IgM抗体检测
    16. 中和试验
    17. Trizol溶解细胞和细胞总RNA提取
    18. 培养上清中病毒RNA提取
    19. Realtime RT-PCR检测HEV RNA
    20. 基因芯片检测：由博奥生物有限公司检测,简要描述如下
    21. 反转录合成细胞总cDNA
    22. 基因芯片验证Realtime PCR
结果
    第一部分：HEV体外细胞培养的建立及培养条件优化
        1. HEV毒种制备及HEV RNA的Realtime RT-PCR定量检测
        2. 候选细胞株的筛选
            2.1 候选细胞株的选择
            2.2 接种量确定
            2.3 筛选结果
        3. 培养基的优化
            3.1 背景
            3.2 MgCl_2对出毒水平的影响
            3.3 DMEM作为生长培养基,DMEM/M199作为维持培养基模式下,对HEV出毒水平的影响
            3.4 同时使用DMEM/M199作为生长培养基和维持培养基的模式下,对HEV出毒水平的影响
        4. 接种条件的优化
            4.1 优化前参数确定
            4.2 孵育时间的优化
            4.3 孵育温度的优化
            4.4 条件优化后不同浓度HEV接种后阳性率结果
        5. DMEM/M199培养基与MEM培养基成份差异及差异成份对HEV出毒的影响
        6. 胆固醇促进HEV出毒效果的确认和特征分析
            6.1 DMEM/M199促进HEV出毒的评价
            6.2 胆固醇对HEV出毒的促进作用分析
        讨论
        小结
    第二部分：HEV 4型培养系统的应用研究
        1. HEV感染细胞形态学观察
            1.1 HEV感染细胞的光镜检查
            1.2 免疫荧光染色
            1.3 激光共聚焦分析感染细胞
            1.4 透射电镜观察病毒颗粒
        2. 细胞培养上清中HEV病毒颗粒是否带有包膜的免疫分析
        3. HEV 4型对理化处理的敏感性
        4. 抗HEV抗体的中和效果检测
        5. HEV在PLC/PRF/5细胞中的传代培养
        6. 基因芯片检测HEV感染诱导的宿主细胞基因表达谱变化
            6.1 HEV感染诱导的宿主细胞基因表达谱变化
            6.2 芯片检测结果的Realtime PCR验证
            6.3 表达水平改变基因的基本功能注释
        7. 干扰素-α2b(IFN-α2b)对HEV复制的抑制效应
            7.1 IFN-α2b对HEV接种细胞的细胞毒作用评价
            7.2 IFN-α2b对HEV出毒的抑制效应评价
        讨论
        小结
参考文献
附录1: 主要仪器设备
附录2: 缩略语
附录3: 胆固醇促出毒作用分析检测结果和统计学分析
博士期间发表的论文
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]急性戊型肝炎临床分析221例[J]. 黄云丽,李卓,郝娃,谢玉兰,陈新月.  世界华人消化杂志. 2009(18)
[2]戊型肝炎临床特征及发病趋势[J]. 肖非,马科,王俊文,许东,田德英.  内科急危重症杂志. 2006(03)
[3]抗戊型肝炎病毒E2 IgM诊断急性戊型肝炎的敏感性和特异性[J]. 郑玲,柳丽娟,胡莹盈,王艳丽,温珠妹,张宇,陈惠聪,张启云,江家骥.  中华肝脏病杂志. 2005(08)
[4]戊型肝炎病毒在人胚肺二倍体细胞KMB17等传代细胞中的繁殖[J]. 乐耕耘,吴娟,马雁冰,杜瑞娟,庄俊英,谢天宏,李春宏,戴长柏,孙茂盛.  中国医学科学院学报. 2001(06)



本文编号：3608365