PD1鼠源抗体的人源化及其活性鉴定

发布时间：2023-04-08 02:11

　　PD1作为一个重要的免疫检验点蛋白,对T细胞的发育和功能起着重要的作用。PD1的配体PDL1,在许多肿瘤细胞表面都有表达,它们能够抑制T细胞的葡萄糖消耗、细胞因子的产生、增殖甚至是存活率。阻断PD1的抑制信号可以促进T细胞的激活,增强机体的免疫反应。因此,PD-1抗体已成为最具前途的抗肿瘤治疗药物,代表着肿瘤免疫治疗最重大的里程碑事件。鼠源抗体的人源化主要是通过分子克隆等技术,将一些异源氨基酸序列替换为人源序列,在维持抗体亲和力和生物活性的情况下,这种改造大大降低了免疫原性,增加了在临床治疗使用中的安全性。在我们实验室先前的工作中已获得了表达PD1鼠源单克隆抗体的杂交瘤细胞,并成功纯化出了PD1鼠源单克隆抗体。我们首先对这株抗体的亚型进行了鉴定,该抗体的轻链和重链分别为Kappa链和Ig G链。其次我们提取了杂交瘤细胞的RNA反转录,对PD1鼠源单克隆抗体的可变区基因进行扩增调取,然后将该抗体的可变区通过分子克隆与人源Kappa链和Ig G链拼接,构建到真核表达载体上。通过流式细胞分析,将这株鼠源嵌合抗体的亲和力与鼠源单克隆抗体进行比较,发现亲和力会随恒定区的改变而下降。随后,我们又对...

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引言
材料与方法
    1.实验材料
        1.1 主要仪器与设备
        1.2 主要试剂和材料
        1.3 主要试剂配方
        1.4 主要载体、宿主菌和细胞系
    2.实验方法
        2.1 杂交瘤细胞RNA提取
        2.2 鼠源单克隆抗体亚型鉴定
        2.3 RT-PCR
        2.4 重链及轻链可变区基因PCR
        2.5 核酸凝胶回收
        2.6 PCR或双酶切产物清洁
        2.7 TA克隆
        2.8 转化
        2.9 质粒小量抽取
        2.10 高保真PCR扩增
        2.11 双酶切反应
        2.12 酶连反应
        2.13 真核表达
        2.14 Elisa检测
        2.15 质粒中量抽取
        2.16 抗体纯化
        2.17 SOE-PCR
        2.18 流式细胞分析
        2.19 混合淋巴反应
结果
    1.PD1杂交瘤细胞RNA提取
    2.PD1鼠单抗亚型鉴定
    3.PD1鼠单抗重链和轻链可变区基因提取
    4.PD1鼠嵌合抗体表达载体的构建
    5.PD1鼠嵌合抗体小量表达及活性检测
    6.PD1鼠嵌合抗体大量表达与纯化
    7.PD1人源化嵌合抗体表达载体的构建
    8.PD1人源化嵌合抗体小量表达及活性检测
    9.PD1人源化嵌合抗体大量表达与纯化
    10.PD1鼠嵌合抗体与PD1人源化嵌合抗体纯化后活性鉴定
    11.PD1抗体细胞亲和力流式检测
    12.混合淋巴反应测定PD1抗体活性
讨论
参考文献
综述 Nivolumab和pembrolizumab在靶向PD1免疫治疗中的比较
    参考文献
致谢



本文编号：3785790