提高PDMAEMA/DNA复合物基因转染效率和血清稳定性的研究

发布时间：2023-04-29 03:55

　　本文运用原子转移自由基聚合技术一锅法合成了以聚N, N’-双(丙烯酰)胱胺(PBAC)为交联核,以线性聚甲基丙烯酸-N, N’-二甲氨基乙酯(l-PDMAEMA)为臂的星形阳离子聚合物s-PDMAEMA。在二硫代苏糖醇(DTT)还原条件下,s-PDMAEMA显示了可降解能力。s-PDMAEMA聚合物具有比l-PDMAEMA更强的压缩DNA能力。s-PDMAEMA具有优于其对应线性l-PDMAEMA的细胞转染效率,s-PDMAEMA200的转染效果高于PEI25kDa,且毒性更低。通过酸碱滴定实验考察了l-PDMAEMA、s-PDMAEMA载体的质子缓冲效应。采用AFM观察不同pH对l-PDMAEMA/DNA、s-PDMAEMA/DNA复合物形貌的影响。以时间相关荧光光谱技术考察了l-PDMAEMA/DNA、s-PDMAEMA/DNA的核酸降解酶稳定性。结果表明,交联结构聚合物分子内部渗透压提高,星形聚合物表现出了比线性聚合物更强的质子缓冲能力。当环境pH值从7.4降到5.0,l-PDMAEMA/DNA复合物变得更为紧密;相反,由于带正电的臂向外部伸展,s-PDMAEMA/DNA复合物呈...

【文章页数】：112 页

【学位级别】：博士

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摘要
ABSTRACT
第一章 前言
    1.1 概述
    1.2 非病毒基因载体
        1.2.1 阳离子脂质体（Liposome）
        1.2.2 聚乙烯亚胺（PEI）
        1.2.3 树枝状聚合物载体（Dendrimers）
        1.2.4 聚赖氨酸（PLL）
        1.2.5 聚甲基丙烯酸-N, N’-二甲氨基乙酯（PDMAEMA）
    1.3 聚阳离子载体介导的基因转运过程及面临屏障
        1.3.1 复合物的形成
        1.3.2 复合物的血液输送稳定性
        1.3.3 复合物穿越血管内皮层及细胞外基质
        1.3.4 复合物的细胞摄取
        1.3.5 复合物的内涵体逃逸
        1.3.6 复合物的细胞质转运
        1.3.7 细胞核定位
    1.4 提高聚阳离子载体基因转运效率的方法
        1.4.1 提高复合物的血液输送稳定性
        1.4.2 靶向细胞转染
        1.4.3 提高复合物逃离内涵体/溶酶体效果
        1.4.4 提高基因物质细胞质释放效果
        1.4.5 提高DNA的细胞核运输效果
    1.5 课题的提出及研究内容
第二章 星型PDMAEMA聚合物作为基因载体的应用
    2.1 引言
    2.2 实验部分
        2.2.1 原料与试剂
        2.2.2 实验仪器
        2.2.3 星型PDMAEMA聚合物的合成
        2.2.4 傅立叶变换红外光谱检测
        2.2.5 凝胶渗透色谱检测
        2.2.6 二硫键含量的测定
        2.2.7 降解实验
        2.2.8 菌体的培养与质粒DNA的提取
        2.2.9 聚合物/DNA复合物的制备
        2.2.10 聚合物/DNA复合物形貌
        2.2.11 琼脂糖凝胶电泳
        2.2.12 毒性试验
        2.2.13 细胞转染
        2.2.14 荧光素酶活性测定
        2.2.15 BCA法测总蛋白
    2.3 结果与讨论
        2.3.1 星型聚合物的合成及结构表征
        2.3.2 聚合物的分子量及其分布
        2.3.3 星型聚合物的二硫键含量测定
        2.3.4 星型聚合物降解性能考察
        2.3.5 琼脂糖凝胶电泳
        2.3.6 聚合物/DNA复合物的尺寸及形貌
        2.3.7 细胞转染
        2.3.8 细胞毒性
    2.4 本章小结
第三章 星形PDMAEMA载体介导基因转染的机理研究
    3.1 引言
    3.2 实验部分
        3.2.1 原料与试剂
        3.2.2 实验仪器
        3.2.3 滴定实验
        3.2.4 聚合物/DNA复合物的制备
        3.2.5 聚合物/DNA复合物的形貌
        3.2.6 时间分辨荧光分析
    3.3 结果与讨论
        3.3.1 聚合物质子缓冲能力
        3.3.2 聚合物/DNA复合物的形貌
        3.3.3 时间分辨荧光研究
    3.4 本章小结
第四章 PDMAEMA-PMPDSAH共聚物作为基因载体的应用
    4.1 引言
    4.2 实验部分
        4.2.1 原料与试剂
        4.2.2 实验仪器
        4.2.3 PDMAEMA-PMPDSAH嵌段共聚物的合成
        4.2.4 聚合物的表征
        4.2.5 质粒DNA的提取过程
        4.2.6 聚合物/DNA复合物的制备
        4.2.7 聚合物/DNA复合物形貌观察
        4.2.8 琼脂糖凝胶电泳
        4.2.9 Zeta电位和粒度测量
        4.2.10 毒性试验
        4.2.11 细胞转染
        4.2.12 荧光素酶活性测定
        4.2.13 BCA法测总蛋白含量
    4.3 结果与讨论
        4.3.1 PDMAEMA200-PMPDSAHx嵌段共聚物的合成及表征
        4.3.2 凝胶电泳实验
        4.3.3 聚合物/DNA复合物的形貌
        4.3.4 复合物的zeta电位及粒度
        4.3.5 细胞转染
        4.3.6 毒性实验
    4.4 本章小结
第五章 PDMAEMA-PMPDSAH载体介导基因转染的机理研究
    5.1 引言
    5.2 实验部分
        5.2.1 原料与试剂
        5.2.2 实验仪器
        5.2.3 PDMAEMA200-PMPC80嵌段共聚物的合成
        5.2.4 聚合物的结构表征
        5.2.5 质粒DNA的提取
        5.2.6 聚合物/DNA复合物的制备
        5.2.7 琼脂糖凝胶电泳
        5.2.8 细胞转染
        5.2.9 荧光素酶活性测定
        5.2.10 BCA法测总蛋白含量
        5.2.11 细胞内化效率测定
        5.2.12 动态接触角测量
        5.2.13 差示扫描量热分析
    5.3 结果与讨论
        5.3.1 PDMAEMA200-PMPC80嵌段共聚物的合成
        5.3.2 凝胶电泳实验
        5.3.3 细胞转染
        5.3.4 聚合物/DNA复合物的细胞内化效果研究
        5.3.5 动态接触角测量
        5.3.6 聚合物与二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）的相互作用
    5.4 本章小结
第六章 全文结论
参考文献
发表论文和参加科研情况说明
致谢



本文编号：3805116