中国荷斯坦牛INCENP基因的多态性及对精液品质影响

发布时间：2017-03-25 08:13

  本文关键词：中国荷斯坦牛INCENP基因的多态性及对精液品质影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：中国荷斯坦公牛的精液品质显著影响母牛的繁殖效率。近年来,随着分子生物学技术的不断发展,候选基因法在遗传育种中得到了广泛应用。结合国内外相关研究,本研究拟选INCENP基因为候选基因,鉴定与种公牛精液品质相关的功能性SNPs,并分析功能性SNPs的分子调控机理。1.中国荷斯坦牛INCENP基因启动子活性分析根据生物信息软件预测,在INCENP基因5'侧翼区发现一个启动子区。通过构建缺失片段p GL3重组质粒,瞬时转染MLTC-1细胞,确定了5'侧翼区核心启动子位置位于g.-532~g.-145。同时,通过测序发现,在启动子区鉴定出两个SNPs:g.-556GT和g.-692 CT。运用SAS软件进行关联分析,结果表明g.-556 GT与鲜精活力显著相关。另外,利用双荧光素酶报告基因的方法对5'端侧翼区所发现的2个SNPs进行了功能性实验验证,发现p GL3-TG载体的相对荧光素酶活性显著高于野生型的p GL3-CG的活性。推测,g.-556 GT和g.-692 CT为启动子区功能性突变位点,可通过调节启动子活性来调控INCENP基因表达,进而影响精液品质性状。2.中国荷斯坦牛INCENP基因可变剪切体的鉴定及相关SNP功能验证通过RT-PCR、克隆测序在中国荷斯坦牛睾丸组织中检测到1种新的INCENP可变剪接体,命名为INCENP-TV。利用q RT-PCR检测INCENP基因在心、肝、脾、肺、肾、睾丸中的表达水平。结果表明INCENP基因的表达没有组织特异性,但在脾和睾丸中的表达量显著高于其他组织。INCENP参考转录本(INCENP-reference)和新发现的可变剪切体(INCENP-TV),在成年公牛和新生公牛中都有表达,但在成年公牛中的表达量显著高于新生小公牛。另外,在成年公牛的睾丸中,INCENP-TV的表达量显著高于INCENP-reference,然而在新生公牛中差异不显著,推测INCENP基因可能与精子发生密切相关。为了探究可变剪切的产生机理,通过测序在第十一内含子发现一个SNP位点(g.19970 AG)。利用ESEfinder 3.0软件预测分析发现,由于g.19970位点G等位基因的引入增加了SRSF1、SRSF1(Ig M-BRCA1)和SRSF5三种剪切蛋白的结合位点。通过转染实验、RT-PCR及克隆测序技术,发现g.19970位点为A等位基因时存在两种转录本,INCENP-reference和INCENP-TV;但是当A突变为G后,只检测到了INCENP-TV,所以推测此SNP可能增强了剪切因子的作用。另外,运用SAS软件进行关联分析,结果表明g.19970 AG与鲜精活力显著相关。3.中国荷斯坦牛bta-miR-378对INCNEP基因3'UTR靶位点的调控分析通过测序,在INCENP基因3'UTR区发现一个SNP位点:g.34078 TG。运用SAS软件进行关联分析,结果表明g.34078 TG与鲜精活力显著相关。成熟miRNA可影响靶基因m RNA的表达水平,通过RNA22和RNAhybrid软件预测发现,bta-miR-378可以结合到INCENP基因3'非翻译区,且g.34078 TG突变前后结合3'非翻译区能力有变化。分别将野生型和突变型的3'UTR连接到p MIR报告载体中,并且和btamiR-378载体共转染MLTC-1细胞,通过双荧光素酶报告系统分析发现,bta-miR-378可与INCENP基因的3'UTR区结合,并且发现突变型报告基因的表达量低于野生型,表明g.34078 TG-GG与miR-378的结合能力比g.34078 TG-TT强。由此推测,btamiR-378可与INCENP的3'侧翼区结合,从而降低INCENP基因的表达水平。4.中国荷斯坦牛INCNEP基因单倍型组合与精液品质的相关性分析根据鉴定出的g.-556 GT、g.-692 CT、g.19970 AG和g.34078 TG构建单倍型组合,在实验群体中发现7种单倍型和13种单倍型组合。关联分析结果表明,H1H12和H2H2个体的射精量显著高于H2H10和H11H11;H11H11和H2H10鲜精活力显著高于H2H2。由此推测g.-692 CT、g.-556 GT、g.19970 AG和g.34078TG为功能性SNPs,在调控精液性状方面具有重要的作用。5.中国荷斯坦牛INCENP基因不同单倍型组合个体m RNA表达水平通过q RT-PCR评估INCENP基因不同单倍型组合个体的m RNA表达水平。结果表明,单倍型组合个体H11H11(TTTTGGTT)和H1H12(CTGTAGTG)的m RNA表达量显著高于H2H10(CTGTAAGG),H2H2(CCGGAAGG)和H9H12(TTTTAGTG),推测SNPs,g.19970 AG,g.34078 TG,g.-692 CT和g.-556 GT,为INCENP基因的功能性SNPs,可调控INCENP基因的表达水平。
【关键词】：INCENP 可变剪切 启动子 3’UTR bta-miR-378 单倍型组合 精液品质
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S823
【目录】：

• 符号说明4-8
• 中文摘要8-10
• Abstract10-13
• 1 前言13-22
• 1.1 中国荷斯坦种公牛精液品质的研究进展13-18
• 1.1.1 评价种公牛精液品质优劣的相关指标13
• 1.1.2 分子育种在种公牛选育中的重要性13-18
• 1.1.2.1 单核苷酸多态性14
• 1.1.2.2 启动子14-15
• 1.1.2.3 基因选择性剪切15-17
• 1.1.2.4 MicroRNAs17-18
• 1.2 INCENP基因研究进展18-21
• 1.2.1 染色体乘客复合体18-20
• 1.2.2 INCENP基因的结构与功能20-21
• 1.2.3 INCENP基因研究概况及意义21
• 1.3 本论文的研究目的及意义21-22
• 2 材料与方法22-37
• 2.1 实验材料22-24
• 2.1.1 实验动物和实验样品采集22
• 2.1.2 实验仪器22-23
• 2.1.3 实验试剂23-24
• 2.2 实验方法24-37
• 2.2.1 INCENP基因启动子活性分析24-29
• 2.2.1.1 基因启动子预测24
• 2.2.1.2 公牛精子DNA提取24
• 2.2.1.3 INCENP基因启动子区SNPs鉴定及PCR-RFLP基因分型24-26
• 2.2.1.4 INCENP基因启动子区载体构建及鉴定26-27
• 2.2.1.5 细胞培养27-28
• 2.2.1.6 细胞瞬时转染28
• 2.2.1.7 荧光素酶活性检测28
• 2.2.1.7 INCENP基因启动子区SNPs与精液品质关联分析28-29
• 2.2.2 INCENP基因可变剪切体鉴定与表达分析29-33
• 2.2.2.1 各组织总RNA的提取和cDNA的合成29
• 2.2.2.2 目的片段胶回收29-30
• 2.2.3.3 TA克隆30
• 2.2.2.4 荧光定量PCR30
• 2.2.2.5 INCENP基因可变剪切体相关SNPs的鉴定、PCR-RFLP基因分型及功能预测30-31
• 2.2.2.6 pSPL3外显子捕获载体质粒构建31-32
• 2.2.2.7 细胞瞬时转染32-33
• 2.2.2.9 INCENP基因编码区SNP与精液品质关联分析33
• 2.2.3 bta-miR-378对INCNEP基因 3’TR靶位点的调控分析33-35
• 2.2.3.1 基因 3'翼区SNPs鉴定及PCR-RFLP33
• 2.2.3.2 靶向 3'TR的mi RNA预测及表达分析33-34
• 2.2.3.3 INCENP基因 3'UTR质粒构建34
• 2.2.3.4 bta-miR-378质粒构建34-35
• 2.2.3.5 细胞瞬时转染及荧光检测35
• 2.2.3.6 INCENP基因 3'UTR区SNP与精液品质关联分析35
• 2.2.4 INCNEP基因单倍型组合与精液品质的相关性分析35
• 2.2.4.1 运用SAS软件分析不同INCENP基因单倍型组合与精液品质的相关35
• 2.2.5 INCENP基因mRNA表达水平35-37
• 2.2.5.1 冻精RNA提取35-36
• 2.2.5.2 qRT-PCR分析不同INCENP基因单倍型组合个体mRNA表达36-37
• 3 结果与分析37-53
• 3.1 INCENP基因启动子活性分析37-41
• 3.1.1 启动子区预测37
• 3.1.2 冻精DNA提取37-38
• 3.1.3 INCENP基因启动子区SNPs鉴定、功能预测及PCR-RFLP分型38-39
• 3.1.4 荧光检测及启动子活性分析39-40
• 3.1.5 INCENP基因启动子区SNPs与公牛精液性状的相关性分析40-41
• 3.2 INCENP基因可变剪切体鉴定与表达分析41-48
• 3.2.1 各组织RNA质量和纯度检测41-42
• 3.2.2 INCENP基因可变剪切体鉴定42-43
• 3.2.3 转录本相对定量43-44
• 3.2.4 SNP的鉴定、PCR-RFLP及功能预测44-45
• 3.2.5 pSPL3外显子捕获载体质粒构建45-46
• 3.2.6 通过微基因剪切实验验证SNP对可变剪切体产生的影响46-47
• 3.2.7 INCENP基因编码区SNPs与公牛精液性状的相关性分析47-48
• 3.3 bta-miR-378对INCNEP基因 3'UTR靶位点的调控分析48-51
• 3.3.1 3'UTR区SNP的鉴定及PCR-RFLP48-49
• 3.3.2 靶向 3'UTR的mi RNA预测及表达分析49-50
• 3.3.3 双荧光素酶报告基因系统验证SNP功能50
• 3.3.4 INCENP基因 3'UTR区SNPs与公牛精液性状的相关性分析50-51
• 3.4 INCNEP基因单倍型组合与精液品质的相关性分析51-52
• 3.4.1 不同单倍型组合与精液品质相关性分析51-52
• 3.5 INCENP基因不同单倍型组合个体mRNA表达水平52-53
• 4 讨论53-56
• 5 结论56-57
• 参考文献57-66
• 致谢66-67
• 攻读学位期间发表论文情况67

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