Apa2H1单聚体和三聚体抗原体外活化BMDCs和对小鼠免疫保护作用的比较

发布时间：2017-03-31 13:09

  本文关键词：Apa2H1单聚体和三聚体抗原体外活化BMDCs和对小鼠免疫保护作用的比较，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)是引起猪高度传染性、致死性胸膜肺炎的病原菌,现该病已经成为育肥猪和种猪死亡的主要原因之一。该病原菌分为15个血清型,我国流行的血清型主要为1、3、5和7型,由于疫苗免疫时各血清型间无交叉保护作用,给该病的防治带来很大困难。三聚体自转运粘附素(Trimeric Autotransporter Adhesins,TAAs)是新发现存在于多种致病性革兰氏阴性菌表面的毒力因子,主要介导细菌的粘附、定植和免疫逃避,头部Yad A结构域为其主要功能区。尽管已有研究表明TAAs具有良好的免疫原性,但发挥免疫保护作用的具体结构域尚无统一定论;同时TAAs自然状态成三聚体结构,但此三聚体结构在免疫原性和免疫保护作用方面与单聚体抗原是否存在差异目前仍不明确。本研究以前期发现的APP血清5b型L20菌株表面TAA结构Apa2为代表,通过预测Apa2的功能区为Apa2H1,并以Apa2H1为研究对象,研究三聚体抗原与单聚体抗原在免疫原性方面的差异,为新型亚单位疫苗的制备提供新的理论依据。通过将Apa2头部功能区Apa2H1分别克隆至含有Hia蛋白C-末端跨膜区修饰的p NS载体和p ET-28a载体,利用原核表达系统表达分别获得类似天然状态的三聚体Apa2H1蛋白和单聚体Apa2H1蛋白。将获得的单聚体、三聚体Apa2H1蛋白与APP宿主细胞猪肺上皮细胞系(SJPL)和猪肺巨噬细胞系(CRL)相互作用检测Apa2H1蛋白粘附细胞的能力;将表达单聚体、三聚体Apa2H1蛋白的大肠杆菌分别与正常或单聚体、三聚体Apa2H1蛋白预处理的SJPL和CRL相互作用,检测Apa2H1在细菌粘附和侵袭细胞中的作用;最后将APP与正常或单聚体、三聚体Apa2H1蛋白预处理的SJPL和CRL相互作用,验证Apa2H1蛋白在APP粘附和侵袭宿主细胞中的作用。结果显示两种形式的Apa2H1蛋白均可以直接粘附细胞,并显著促进细菌粘附和侵袭细胞,而宿主细胞与Apa2H1蛋白预作用可以降低Apa2H1蛋白的这种促进作用。证实Apa2H1蛋白是Apa2的功能结构域,参与细菌的粘附和侵袭。为探讨Apa2H1蛋白是否具有免疫原性,能否用于开发APP亚单位疫苗,首先将三聚体Apa2H1蛋白在体外与小鼠骨髓来源的树突状细胞(bone marrow dendritic cells,BMDCs)相互作用,检测其活化BMDCs的能力;再将三聚体Apa2H1蛋白与弗氏佐剂混合后免疫小鼠,体内检测Apa2H1蛋白的免疫原性和免疫保护作用。结果显示Apa2H1蛋白在体外具有刺激活化BMDCs的能力,并能诱导多种T、B淋巴细胞增殖、分化、活化诱导因子的释放;Apa2H1蛋白免疫可以诱导高强度的体液免疫和适度的Th1/Th2混合T细胞应答,且产生的特异性免疫应答在APP感染早期和晚期分别可以显著(p0.05)和极显著(p0.01)的降低APP在小鼠肺脏和血液的定植,降低肺脏炎症反应程度,提高小鼠的存活率(40%,p0.01)。证实Apa2H1蛋白具有良好的免疫原性,并具有免疫保护作用,是APP潜在的疫苗候选蛋白。为进一步探讨三聚体抗原和单聚体抗原的抗原学差异,本研究以Apa2H1抗原为代表,首先将Apa2H1三聚体、单聚体蛋白在体外与BMDCs作用,观察活化BMDCs能力的差异;再分别添加佐剂和不添加佐剂免疫小鼠,在体内检测两种抗原在小鼠体内的免疫学差异。结果显示三聚体抗原刺激活化BMDCs的能力显著强于(p0.05)单聚体抗原;在有佐剂免疫时三聚体、单聚体诱导小鼠产生的特异性抗体水平和免疫保护作用无显著差异(p0.05),但是在无佐剂免疫时,三聚体在初次免疫和加强免疫后均可以诱导更高水平的特异性抗体,与单聚体抗原免疫相比较,能显减低肺脏炎性细胞浸润和显著延迟感染致死剂量APP小鼠的死亡时间(p0.05)。从体外、体内实验证实三聚体抗原的抗原性优于单聚体抗原。本研究证实Apa2H1头部结构域是Apa2的主要功能区,并初步阐明其可以促进APP对宿主细胞的粘附、侵袭;同时证实了此头部功能区具有良好的免疫原性,是APP潜在的疫苗候选蛋白;提供了制备三聚体蛋白的新方法,证明了三聚体抗原较单聚体抗原具有更好的免疫原性。此成果不但可直接用于猪传染性胸膜肺炎疫苗研究,有助于猪胸膜肺炎放线杆菌的防治,减少国内外养猪业的经济损失;更为新型三聚化蛋白疫苗的研究提供理论和实验基础。
【关键词】：胸膜肺炎放线杆菌 三聚体自转运粘附素 三聚体抗原 单聚体抗原 BMDCs 免疫原性
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.4
【目录】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-12
• 中英文缩略词12-13
• 前言13-15
• 第一篇 文献综述15-28
• 1. 三聚体自转运粘附素的共同分子结构16-19
• 2. TAAs的跨膜转运19-21
• 3. TAAs功能及其机制的新发现21-25
• 4. TAAs的潜在应用25-27
• 5. 未来TAAs的研究方向的评述27-28
• 第二篇 研究内容28-89
• 第1章 Apa2H1单聚体、三聚体抗原的制备和功能研究28-51
• 1.1 材料与方法29-39
• 1.2 结果39-47
• 1.3 讨论47-50
• 1.4 小结50-51
• 第2章 Apa2H1单聚体、三聚体对BMDCs的活化作用51-67
• 2.1 材料与方法52-56
• 2.2 结果56-65
• 2.3 讨论65-66
• 2.4 小结66-67
• 第3章 Apa2H1三聚体蛋白的体内免疫原性及对小鼠的免疫保护作用67-81
• 3.1 材料与方法67-70
• 3.2 结果70-78
• 3.3 讨论78-80
• 3.4 小结80-81
• 第4章 Apa2H1单聚体、三聚体蛋白体内免疫原性和免疫保护作用差异比较81-89
• 4.1 材料与方法81-82
• 4.2 结果82-87
• 4.3 讨论87-88
• 4.4 小结88-89
• 结论89-90
• 参考文献90-99
• 导师简介99-100
• 作者简介100-101
• 攻读硕士期间发表的学术论文及其他成果101-102
• 致谢102

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