DEV感染对鸭主要TLRs转录水平影响研究

发布时间：2017-04-01 07:07

  本文关键词：DEV感染对鸭主要TLRs转录水平影响研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：鸭肠炎病毒(Duck enteritis virus,DEV)又称鸭瘟病毒(Duck plague virus,DPV),是危害养鸭业健康发展的重要病原之一。目前对DEV的研究主要集中在基因结构与功能、快速检测技术及诱导特异性免疫应答反应等方面,但在DEV感染与鸭天然免疫应答方面研究较少。Toll样受体(Toll like receptors,TLRs)作为一种天然免疫分子,可通过机体自身的表面模式识别受体识别病原微生物的损伤相关分子模式并激活胞内信号传导,诱导炎性因子以及细胞因子的产生,最终达到清除入侵病原体的目的。因此,本文开展了DEV感染对鸭TLRs基因转录和细胞因子分泌的影响研究,以期为鸭病毒性肠炎(鸭瘟)的预防与控制提供新思路。主要研究内容包括:1.健康鸭组织中TLR2、TLR3和TLR7基因的相对转录水平根据Gen Bank上鸭TLR2、TLR3、TLR7和β-actin基因设计特异性引物,以β-actin为内参,采用实时荧光定量PCR对鸭机体组织TLR2、TLR3和TLR7基因转录量进行检测分析,结果发现:TLR2、TLR3和TLR7基因m RNA在所检测组织中均有不同程度转录,其中TLR2基因在脾脏中转录最高,依次是肝脏、胰脏、肾脏、气管、肺脏、十二指肠、肌肉、心脏和脑;TLR3基因在肝脏中转录最高,依次是肾脏、脾脏、气管、心脏、肺脏、胰脏、肌肉、十二指肠和脑;TLR7基因在脾脏中转录最高,依次是肝脏、胰脏、肺脏、气管、十二指肠、肾脏、肌肉和脑。2.DEV感染对鸭组织中TLR2、TLR3和TLR7基因转录的影响采集DEV感染后不同时间段鸭组织样本,提取组织样本总RNA,采用实时荧光定量PCR对鸭机体组织TLR2、TLR3和TLR7基因转录量进行检测分析,结果发现:与正常组相比较,TLR2、TLR3和TLR7基因在鸭体不同组织中转录均发生不同程度变化,其总体趋势是,随着DEV感染时间的推进,三种Toll样基因转录呈现倒“S”变化,即先升高后降低再升高的现象,但Toll样受体基因在同一感染时间上不同鸭体组织的转录变化未呈现出一定的规律性。3.DEV感染对鸭血清和外周淋巴细胞中细胞因子分泌的影响采集DEV感染后不同时间段鸭血清样本,采用ELISA测定IL-2、IL-6、IL-8、IFN-β和IFN-γ含量,结果发现:DEV感染后鸭血清中IL-2、IL-6、IL-8、IFN-β和IFN-γ分泌均发生不同程度的变化,其中IL-2在6h时最高,120h时最低;IL-6在72h前趋于稳定,96h时降到最低;IL-8在6h时最高,96h时最低;IFN-β开始时降低,6~48h时升高,后又降低,至96h时开始上升;IFN-γ在6h时最高,18~120h时呈整体下降趋势,至168h时升高。分离健康鸭血液中外周淋巴细胞,培养呈单层细胞后,感染DEV,收集感染后不同时间细胞样本,采用ELISA方法测定IL-2、IL-6、IL-8、IFN-β和IFN-γ含量,结果发现:DEV感染后鸭外周淋巴细胞中IL-2、IL-6、IL-8、IFN-β和IFN-γ分泌均发生不同程度的变化,其中IL-2和IL-6呈现持续上升,至4h后分泌趋于稳定;IL-8在1h时开始下降,4h时上升至最高,8h时下降,12h上升;IFN-β在1h时开始上升,4~8h时持续下降,12h时上升;IFN-γ在1h时无变化,4h时上升,8h时下降,12h时上升。结论:TLR2、TLR3和TLR7基因在正常鸭组织中具有不同程度的转录,感染DEV后其转录水平发生一定的变化,总体趋势没有规律性;鸭血清和鸭外周淋巴细胞中IL-2、IL-6、IL-8和IFN-γ分泌变化趋势大致相同,而IFN-β不同。
【关键词】：鸭肠炎病毒 TLRs 细胞因子 荧光定量PCR ELISA
【学位授予单位】：贵州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.32
【目录】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-9
• 缩略词9-10
• 文献综述10-22
• Toll 样受体的研究进展10-17
• 细胞因子研究进展17-22
• 第一章 正常鸭源TLRs基因的组织转录水平研究22-38
• 1 材料23
• 1.1 实验动物23
• 1.2 主要试剂23
• 1.3 主要仪器23
• 2 方法23-27
• 2.1 引物设计与合成23-24
• 2.2 RNA提取及cDNA合成24-26
• 2.3 荧光定量PCR反应体系及程序26-27
• 2.4 数据处理27
• 3 结果27-34
• 3.1 RQ-PCR产物的特异性以及扩增效率分析27-31
• 3.2 TLRs基因的组织表达谱31-34
• 4 讨论34-38
• 4.1 关于荧光定量检测方法的建立34
• 4.2 关于TLR2、TLR3和TLR7基因mRNA转录水平研究34-38
• 第二章 DEV感染对鸭主要TLR基因转录水平影响研究38-72
• 1 材料39
• 1.1 实验动物39
• 1.2 主要试剂39
• 1.3 主要仪器39
• 2 方法39-40
• 2.1 人工感染及样品采集39
• 2.2 引物设计与合成39
• 2.3 总RNA提取及cDNA合成39
• 2.4 荧光定量PCR反应体系及程序39
• 2.5 数据处理39-40
• 3 结果40-70
• 3.1 DEV感染后鸭TLR2基因的组织转录水平40-50
• 3.2 DEV感染后TLR3基因的组织转录差异50-60
• 3.3 DEV感染后TLR7基因的组织转录差异60-70
• 4 讨论70-72
• 4.1 关于免疫与TLRs70
• 4.2 关于DEV感染与TLRs70-72
• 第三章 DEV感染对鸭主要细胞因子表达影响研究72-83
• 1 材料73
• 1.1 实验动物73
• 1.2 主要试剂73
• 1.3 主要仪器73
• 2 方法73-75
• 2.1 DEV感染鸭及样品采集73-74
• 2.2 外周淋巴细胞的制备及处理74
• 2.3 细胞因子水平检测74-75
• 2.4 数据统计分析75
• 3 结果75-81
• 3.1 DEV感染后鸭血清中五种细胞因子分泌水平75-78
• 3.2 DEV感染后鸭外周淋巴细胞中细胞因子的分泌情况78-81
• 4 讨论81-83
• 4.1 DEV感染对鸭血清中细胞因子的影响81-82
• 4.2 DEV感染外周淋巴细胞中细胞因子的影响82-83
• 全文结论83-84
• 参考文献84-91
• 附录 攻读硕士学位期间发表论文情况91-92
• 致谢92-93

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