抗犬瘟热病毒中药化学成分筛选及异绿原酸A对MDCK细胞TLR3信号通路的影响

发布时间：2017-04-02 02:11

  本文关键词：抗犬瘟热病毒中药化学成分筛选及异绿原酸A对MDCK细胞TLR3信号通路的影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：犬瘟热(CD)是由犬瘟热病毒(CDV)引起的一种传染性和多系统性的病毒性疾病,影响家养和野生犬科动物以及其它陆地和水生食肉动物的健康,尽管该疾病在一定程度上由疫苗接种得以控制,但是已接种疫苗的动物也时常有该疾病的发生,因此使用药物进行治疗发病动物是重要的弥补措施。作为天然药物的重要组成部分,中药具有广泛的抗病毒活性,其抗病毒研究主要从中药化学成分、单味中药和中药复方制剂三个方面进行,筛选有效的中药化学成分已成为当前抗病毒新药研发的一个热点。本研究选择了虫草素、丹皮酚、橄榄苦苷、梓醇、根皮素、芍药苷、迷迭香酸、咖啡酸、菊苣酸、异绿原酸A、莲心碱、紫草素、芹菜素13种中药化学成分,进行抗CDV活性筛选。CDV属于副粘液病毒科麻疹病毒属成员,其负极性非分段的单链RNA基因组由脂质膜所包裹,该基因组在其复制增殖过程中会产生ds RNA分子,TLR3可识别ds RNA进而激活炎症通路和Ⅰ型干扰素的产生,因此前炎症性因子及辅助刺激分子得以释放,调节机体细胞免疫防御或者加重机体细胞的炎症反应,因而从TLR 3信号通路研究中药化学成分抗CDV作用具有重要的理论意义和实践价值,因此本研究进一步探讨异绿原酸A对狗肾细胞(MDCK)TLR3信号通路的影响。为了更好的评价所筛选药物对CDV的作用,首先对Gen Bank提交的CDV核衣壳蛋白(NP)基因序列进行分析对比,设计多株犬瘟热病毒的通用引物和Taq Man通用探针,建立一种以体外转录RNA为标准品的一步法荧光定量PCR检测方法,用于检测CDV核酸的变化。所建立的CDV荧光定量PCR检测方法灵敏度可达4.02个拷贝/μL,比普通RT-PCR方法的灵敏度高出100倍。对犬细小病毒(CPV)、犬腺病毒(CAV-1)、犬冠状病毒(CCV)、犬副流感病毒(CP IV)核酸检测为阴性,具有很好的特异性。采用CCK-8法分别检测了13种中药化学成分对Vero细胞的毒性作用,从而确定了半数细胞毒性浓度(CC50)。使用100TCID50病毒同时作用于Vero细胞2 h后洗去病毒上清,将不同剂量的候选中药化学成分加入,依据CPE法测定了中药化学成分的抗病毒作用。结果发现迷迭香酸、咖啡酸、菊苣酸、异绿原酸A对CDV体外的最大抑制率(MIR)均大于75%,治疗指数(TI)均大于4。使用一步法荧光定量PCR检测其治疗后的核酸均显著低于未治疗组,表明这几种药物可显著在体外抑制CDV增殖。进一步研究这几种药物对病毒的预防作用和直接灭活作用,结果发现这几种药物并没有显著的直接灭活病毒作用和预防病毒感染作用。选择异绿原酸A作为所筛选抗病毒药物的代表,研究其对MDCK细胞感染CDV后TLR3及相关基因表达的影响,并测定了其对IFN-β分泌量的影响;结果表明50μg/ml、75μg/ml的药物对IL-Iβ、IL-6、TNF-α、TLR3基因转录水平均有显著的下调作用,但对IFN-β的分泌量影响不显著。综上所述,迷迭香酸、咖啡酸、菊苣酸、异绿原酸A四种药物在体外对犬瘟热病毒感染具有治疗作用,但没有明显的灭活病毒作用和预防病毒感染作用;异绿原酸A可以通过影响TLR3信号通路发挥抗犬瘟热病毒感染MDCK细胞的作用;这些结果表明,迷迭香酸、咖啡酸、菊苣酸,异绿原酸A可以作为潜在抗犬瘟热病毒的物质。
【关键词】：一步法荧光定量PCR 抗犬瘟热病毒 异绿原酸A TLR3
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 前言11-13
• 第一篇 文献综述13-27
• 第一章 13种中药化学成分研究进展13-22
• 1.1 咖啡酸、迷迭香酸、菊苣酸、异绿原酸A研究进展13-16
• 1.2 虫草素研究进展16
• 1.3 丹皮酚研究进展16-17
• 1.4 芍药苷研究进展17
• 1.5 梓醇研究进展17-18
• 1.6 其它药物研究进展18-22
• 第二章 犬瘟热病防治研究进展22-27
• 2.1 病原学特征22-23
• 2.2 犬瘟热病毒对TLR3的影响23
• 2.3 犬瘟热的发病机理23
• 2.4 犬瘟热的防控23-25
• 2.5 犬瘟热的治疗25-27
• 第二篇 研究内容27-65
• 第一章 犬瘟热病毒一步法荧光定量PCR检测方法的建立27-38
• 1.1 材料27-29
• 1.2 方法29-32
• 1.3 结果32-36
• 1.4 讨论36-37
• 1.5 小结37-38
• 第二章 抗犬瘟热病毒活性中药化学成分筛选38-50
• 2.1 材料38-39
• 2.2 方法39-42
• 2.3 结果42-48
• 2.4 讨论48-49
• 2.5 小结49-50
• 第三章 异绿原酸A对MDCK细胞TLR3信号通路的影响50-65
• 3.1 材料50-51
• 3.2 方法51-56
• 3.3 结果56-62
• 3.4 讨论62-64
• 3.5 小结64-65
• 结论65-66
• 参考文献66-79
• 导师简介79-80
• 作者简介80-81
• 致谢81

【参考文献】

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本文编号：281699