鸭疫里氏杆菌分离株抗原性分析及乳胶凝集试验的建立

发布时间：2024-02-15 23:32

　　鸭疫里氏杆菌(Riemerellaanatipestifer,RA)病是由鸭疫里氏杆菌引起家鸭、火鸡、鹅和其它多种禽类的一种接触性传染病，又名称鸭传染性浆膜炎；感染鸭表现主要临床症状是精神沉郁、共济失调、角弓反张和淡绿色下痢等；病理变化主要有纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、干酪性输卵管炎、脑膜炎、结膜炎、关节炎和败血症等。该病的发病率和死亡率很高，血清型众多，而各个血清型之间缺乏免疫保护，给该病的防治工作带来困难，已对养鸭业造成了巨大的经济损失。 从黑龙江、山东和广东疑似RA感染的鸭场分离到4株细菌，经菌落形态观察、染色镜检、生化鉴定确定为RA，分别命名为HLG1、SD0901、SD0902和GD0901；利用平板凝集试验对RA进行血清型鉴定，其中HLG1、SD0901和GD0901是血清1型菌株。药敏试验表明，4株分离菌株对嗯诺沙星、氧氟沙星和先锋霉素V相对敏感，但对卡那霉素和庆大霉素均耐药。PCR扩增了RA的外膜蛋白A(OmpA)基因，克隆测序结果显示，4个RA分离株的ompA基因全长均为1164bp，编码387个氨基酸，在核苷酸水平上的同源性为89%¹00%...

【文章页数】：93 页

【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
第一章 综述
    1.1 鸭疫里氏杆菌病的概述
        1.1.1 鸭疫里氏杆菌分类地位及命名
        1.1.2 鸭疫里氏杆菌的形态及生长特性
        1.1.3 鸭疫里氏杆菌的理化特征
        1.1.4 鸭疫里氏杆菌的临床症状及病理变化
        1.1.5 鸭疫里氏杆菌的流行病学特性
        1.1.6 鸭疫里氏杆菌的血清型研究
    1.2 鸭疫里氏杆菌毒力因子的研究
        1.2.1 溶血素
        1.2.2 外膜蛋白
        1.2.3 荚膜多糖
        1.2.4 脂多糖
        1.2.5 粘附素
        1.2.6 热休克蛋白
    1.3 鸭疫里氏杆菌诊断技术
        1.3.1 涂片镜检
        1.3.2 细菌的分离培养
        1.3.3 琼脂扩散沉淀试验
        1.3.4 间接血凝试验
        1.3.5 聚合酶链反应
        1.3.6 环介导等温扩增技术
        1.3.7 荧光抗体技术
        1.3.8 间接酶联免疫吸附试验
    1.4 鸭疫里氏杆菌防治及其疫苗研究
        1.4.1 药物防治
        1.4.2 疫苗的预防
    1.5 乳胶凝集试验的研究进展
        1.5.1 乳胶凝集试验的原理
        1.5.2 乳胶凝集试验的研究现状
    1.6 本研究的目的和意义
第二章 鸭疫里氏杆菌的分离鉴定及其对SPF鸭的致病性研究
    2.1 材料和方法
        2.1.1 菌株、血清和质粒
        2.1.2 病料来源和实验动物
        2.1.3 主要试剂
        2.1.4 主要仪器设备
        2.1.5 细菌分离和生化鉴定
        2.1.6 血清型的鉴定
        2.1.7 细菌药敏试验
        2.1.8 OmpA基因的引物设计与合成
        2.1.9 基因组DNA的制备
        2.1.10 OmpA基因的PCR扩增
        2.1.11 PCR产物的回收与纯化
        2.1.12 感受态细胞的制备（氯化钙法）
        2.1.13 纯化产物OmpA的连接与转化
        2.1.14 提取重组质粒OmpA
        2.1.15 重组质粒的酶切鉴定和序列分析
        2.1.16 HLG1分离株对SPF鸭的致病性试验
    2.2 结果
        2.2.1 细菌的分离与鉴定结果
        2.2.2 生化鉴定结果
        2.2.3 血清型的鉴定结果
        2.2.4 药敏试验结果
        2.2.5 OmpA基因PCR扩增结果
        2.2.6 重组质粒酶切鉴定结果
        2.2.7 OmpA基因序列系统进化树分析结果
        2.2.8 HLG1分离株对SPF鸭的致病性试验结果
    2.3 讨论
第三章 鸭疫里氏杆菌主要蛋白的克隆、表达和抗原性分析
    3.1 材料和方法
        3.1.1 菌株和质粒
        3.1.2 主要试剂
        3.1.3 主要仪器设备
        3.1.4 实验动物
        3.1.5 主要试剂的配方
        3.1.6 引物设计与合成
        3.1.7 PCR扩增Riean-0791、Riean-1110和Riean-1852基因
        3.1.8 PCR产物的回收与纯化
        3.1.9 连接与转化
        3.1.10 重组质粒与测序分析
        3.1.11 重组表达质粒的构建及其酶切鉴定
        3.1.12 重组质粒的诱导表达与SDS-PAGE分析
        3.1.13 包涵体蛋白的纯化
        3.1.14 表达产物的Westernblot分析
        3.1.15 免疫接种及攻毒保护试验
        3.1.16 免疫鸭血清的抗体效价的测定
        3.1.17 细菌膜蛋白的提取方法
        3.1.18 细菌膜蛋白的SDS-PAGE电泳与Westernblot鉴定
    3.2 结果
        3.2.1 Riean-0791基因的克隆、表达及鉴定结果
        3.2.2 Riean-1110基因的克隆、表达及鉴定结果
        3.2.3 Riean1852基因的克隆、表达及鉴定结果
        3.2.4 RA-HLG1菌液对免疫鸭的攻毒免疫保护试验结果
        3.2.5 免疫鸭血清抗体效价的检测结果
        3.2.6 RA-HLG1株细菌外膜蛋白的提取结果
        3.2.7 Riean0791、Riean1110和Riean1852蛋白在细菌中的定位结果
    3.3 讨论
第四章 乳胶凝集试验方法(LAT)的建立及其应用
    4.1 材料和方法
        4.1.1 主要试剂
        4.1.2 乳胶凝集相关缓冲液的配制
        4.1.3 蛋白的复性
        4.1.4 羧化乳胶的致敏方法
        4.1.5 最佳偶联蛋白量的选择
        4.1.6 最佳偶联时间的选择
        4.1.7 最佳羧化乳胶浓度的选择
        4.1.8 乳胶封闭剂的选择
        4.1.9 偶联反应终止剂的选择
        4.1.10 乳胶凝集试验检测操作及其结果的判定
        4.1.11 特异性和敏感性试验
        4.1.12 乳胶凝集试验的重复性试验
        4.1.13 乳胶抗原的保存期试验
        4.1.14 乳胶抗原自凝性检测
        4.1.15 乳胶凝集试验和间接酶联免疫吸附试验符合率试验
    4.2 结果
        4.2.1 最佳偶联Riean0791蛋白量的确定
        4.2.2 最佳偶联时间的确定
        4.2.3 最佳羧化乳胶浓度的选择
        4.2.4 封闭剂的选择
        4.2.5 特异性试验结果
        4.2.6 敏感性试验结果
        4.2.7 偶联反应终止剂的选择
        4.2.8 批内重复性试验结果
        4.2.9 批间重复性试验结果
        4.2.10 乳胶抗原保存期检测结果
        4.2.11 乳胶抗原自凝性检测结果
        4.2.12 乳胶凝集试验（LAT）与间接ELISA的符合率试验结果
    4.3 讨论
第五章 全文结论
参考文献
致谢
作者简历
附录



本文编号：3900427