绵羊卵母细胞“双阶段”成熟培养及p66Shc在绵羊卵母细胞和早期胚胎的表达调控

发布时间：2024-02-19 11:03

　　哺乳动物胚胎体外生产效率低,很大程度上与卵母细胞体外成熟质量差以及卵母细胞和早期胚胎暴露于人工化学合成静态的、不适的体外培养环境中造成的氧化应激有关。哺乳动物卵母细胞和胚胎胞质氧化还原稳态的维持是影响卵母细胞体外成熟质量以及胚胎发育潜能的关键因素之一。科学研究表明,哺乳动物卵巢上卵泡内壁层颗粒细胞产生的生理性旁分泌因子C型利钠肽(C-type Natriuretic Peptide,CNP)具有维持卵母细胞减数分裂停滞的特性。此外,近年的研究表明,原癌基因SHC(Src homology 2 domain-containing transforming protein C,SHC)编码的亚型66KDa线粒体氧化应激蛋白(p66Shc)及其信号特性在调控细胞氧化应激、细胞凋亡和机体衰老过程中发挥了重要作用。本研究旨在探讨C型利钠肽预孵育绵羊卵丘卵母细胞复合体对卵母细胞核减数分裂进程及成熟质量的影响,采用C型利钠肽暂时抑制绵羊卵母细胞核减数分裂进程延长胞质成熟时间,促进核质同步成熟,以期提高绵羊卵母细胞体外成熟质量及其受精后胚胎的发育潜能,同时研究了氧化应激蛋白p66Shc在绵羊卵母细胞和...

【文章页数】：134 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
abstract
缩略语表
1 前言
    1.1 卵子发生和卵泡发育
    1.2 卵母细胞成熟
        1.2.1 卵母细胞体内成熟
        1.2.2 卵母细胞体外成熟
        1.2.3 卵母细胞体外成熟的探索
    1.3 C型利钠肽概述
        1.3.1 C型利钠肽的结构与生物学功能
        1.3.2 C型利钠肽的作用机制
        1.3.3 C型利钠肽对减数分裂的影响
    1.4 线粒体氧化应激
        1.4.1 线粒体活性氧的产生
        1.4.2 线粒体氧化损伤
        1.4.3 线粒体DNA氧化损伤
        1.4.4 线粒体蛋白和脂质氧化损伤
        1.4.5 线粒体呼吸链氧化损伤
    1.5 P66Shc基因的概述
        1.5.1 p66Shc基因的结构与生物学功能
        1.5.2 p66Shc基因对线粒体氧化应激的调控
        1.5.3 p66Shc对线粒体氧化应激的作用机制
    1.6 本研究的目的、意义及主要研究内容
        1.6.1 本研究的目的和意义
        1.6.2 本研究的主要内容
2 实验一C型利钠肽构建绵羊卵母细胞体外“双阶段”成熟培养体系
    2.1 实验材料
        2.1.1 实验样品
        2.1.2 主要试剂与药品
        2.1.3 主要仪器设备
        2.1.4 主要工作液的配制
    2.2 实验方法
        2.2.1 卵母细胞的采集
        2.2.2 CNP预孵育和卵母细胞体外成熟
        2.2.3 卵母细胞减数分裂进程的评估
        2.2.4 体外受精和体外培养
        2.2.5 总RNA提取和cDNA合成
        2.2.6 实时荧光定量PCR
        2.2.7 TUNEL分析
        2.2.8 线粒体染色
        2.2.9 统计分析
    2.3 结果
        2.3.1 CNP预孵育延迟减数分裂进程的恢复
        2.3.2 NPR2的表达
        2.3.3 CNP预孵育提高了绵羊卵母细胞的发育能力
        2.3.4 囊胚的细胞凋亡
        2.3.5 线粒体分布
    2.4 讨论
    2.5 结论
3 实验二P66Shc在绵羊卵母细胞中的表达及其与胞质氧化还原稳态的关系
    3.1 材料与方法
        3.1.1 实验样品
        3.1.2 主要试剂与药品
        3.1.3 主要仪器设备
    3.2 试验方法
        3.2.1 卵母细胞的采集与体外成熟
        3.2.2 实时荧光定量PCR
        3.2.3 线粒体染色和细胞免疫荧光
        3.2.4 ROS检测
        3.2.5 氧化还原稳态检测
        3.2.6 过氧化氢诱导处理
        3.2.7 统计分析
    3.3 结果
        3.3.1 p66Shc在成熟前后不同质量卵母细胞中的相对表达量
        3.3.2 p66Shc蛋白与线粒体在成熟前后不同质量卵母细胞的共定位
        3.3.3 成熟前后不同质量卵母细胞的ROS水平
        3.3.4 成熟前后不同质量绵羊卵母细胞的氧化还原稳态
        3.3.5 过氧化氢诱导的氧化应激上调p66Shc的表达
    3.4 讨论
    3.5 结论
4 实验三P66Shc在绵羊早期植入前胚胎发育过程中的表达和空间定位模式
    4.1 材料与方法
        4.1.1 实验样品
        4.1.2 主要试剂与药品
        4.1.3 主要仪器设备
    4.2 试验方法
        4.2.1 卵母细胞的收集和体外成熟
        4.2.2 体外受精和体外培养
        4.2.3 实时荧光定量PCR
        4.2.4 免疫荧光染色和共聚焦分析
        4.2.5 统计分析
    4.3 结果
        4.3.1 p66Shc在绵羊早期植入前胚胎发育过程中的表达和空间定位模式
        4.3.2 p66Shc及36位丝氨酸(Ser-36)磷酸化的p66Shc在绵羊早期植入前胚胎发育过程中的空间定位模式
    4.4 讨论
    4.5 结论
5 实验四p66Shc参与绵羊植入前胚胎发育过程中H₂O₂诱导的胞质氧化应激
    5.1 材料与方法
        5.1.1 实验样品
        5.1.2 主要试剂与药品
        5.1.3 主要仪器设备
    5.2 试验方法
        5.2.1 卵母细胞的体外成熟、体外受精、体外培养
        5.2.2 实时定量RT-PCR
        5.2.3 氧化应激和抗氧化处理
        5.2.4 免疫荧光染色和共聚焦分析
        5.2.5 氧化还原稳态监测
        5.2.6 TUNEL分析
        5.2.7 检测ROS水平
        5.2.8 统计分析
    5.3 结果
        5.3.1 早期植入前胚胎第一次卵裂的时间影响胚胎的发育能力和囊胚的形成
        5.3.2 早期胚胎质量差伴随着p66Shc表达上调和线粒体功能的下降
        5.3.3 p66Shc参与过氧化氢诱导的氧化应激
        5.3.4 H₂O₂诱导的氧化应激促使p66Shc的36位丝氨酸磷酸化
    5.4 讨论
    5.5 结论
6 实验五siRNA靶向干扰p66Shc基因对绵羊早期胚胎发育潜能的影响
    6.1 材料和方法
        6.1.1 实验样品
        6.1.2 主要试剂与药品
        6.1.3 主要仪器设备
    6.2 试验方法
        6.2.1 卵母细胞收集和体外成熟
        6.2.2 体外受精和体外培养
        6.2.3 显微注射
        6.2.4 RT-qPCR
        6.2.5 ROS检测
        6.2.6 p66Shc免疫荧光检测
        6.2.7 8-OHdG检测
        6.2.8 统计分析
    6.3 结果
        6.3.1 评价合子阶段显微注射siRNA靶向干扰p66Shc基因的效率
        6.3.2 p66Shc基因干扰提高绵羊胚胎的发育潜能
        6.3.3 p66Shc基因干扰降低ROS的产生
        6.3.4 p66Shc基因干扰降低氧化应激标记物8-OHdG的产生
    6.4 讨论
    6.5 结论
7 全文总体结论、创新点
    7.1 总体结论
    7.2 创新点
8 附录
    8.1 附表
致谢
参考文献
作者简介



本文编号：3902583