斯钙素1在初生奶牛胃肠道的表达及其对氧化应激和新型钙离子通道的影响研究

发布时间：2024-02-26 17:54

　　斯钙素1(Stanniocalcin1, STC-1)是一种最初在硬骨鱼类发现的低钙性激素,在鱼类它是由紧邻肾脏而且在整个肾脏中均有分布的特殊器官—斯坦尼氏小体所分泌,该激素主要通过调节腮、小肠和肾脏Ca2+和无机磷酸盐(Inorganic phosphate, Pi)的转运来发挥其抗高钙效应。哺乳动物体内,STC-1在多种器官中均有表达,包括Ca2+吸收上皮如小肠、回肠、肾脏、胎盘以及其它血管化组织。哺乳动物STC-1是一多功能效应蛋白,如它能调节肾脏和肠道Ca2+/Pi吸收,小鼠中其超表达可致高血Pi、侏儒症、代谢率增加等效应,近来发现它和癌症也有一定的联系。STC-1的表达受1,25(OH)2D3等理化因素调节。然而,STC-1在哺乳动物中的多种生理作用还未完全清楚,还有待进一步研究。 1.原核表达牛源STC-1重组蛋白 本试验以奶牛肾脏组织提取的总RNA合成cDNA,然后使用PCR技术扩增出除信号肽序列外的奶牛STC-1全长结构基因。利用T-A克隆原理将扩增产物克隆到pMD-18T载体,转化至DH5α感受态细胞,经过夜培养后挑取单菌落进行扩大培养,然后将菌液进行测序。结果表明该...

【文章页数】：135 页

【学位级别】：博士

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摘要
ABSTRACT
英文缩略表
单位
第一部分 文献综述
    第一章 斯钙素1研究进展
        1.1 STC发现历程
        1.2 鱼类STC
            1.2.1 基因表达调节
            1.2.2 STC靶器官和作用机制
        1.3 STC家族
            1.3.1 哺乳动物STC-1的发现
            1.3.2 哺乳动物STC-1表达和分布
        1.4 哺乳动物STC-1生理功能
            1.4.1 转基因和基因敲除研究
            1.4.2 Ca²⁺/Pi稳态的调节
            1.4.3 对动物发育和亚细胞功能的作用
        1.5 斯钙素和癌症
            1.5.1 斯钙素和癌症的关系
            1.5.2 STC-1在血管生成、细胞增殖和凋亡中的作用
            1.5.3 STC-1和肿瘤微环境
        1.6 总结
    第二章 钙离子转运概述
        2.1 机体Ca²⁺代谢
        2.2 机体Ca²⁺调节
        2.3 机体Ca²⁺转运概述
            2.3.1 细胞旁路转运途径
            2.3.2 跨细胞转运
    第三章 新型钙离子通道研究进展
        3.1 TRPV5和TRPV6
            3.1.1 上皮细胞TRPV5和TRPV6分布
            3.1.2 TRPV5和TRPV6的分子特征
        3.2 Calbindin-D_28K和Calbindin-D9K

        3.3 NCX和PMCA
第二部分 试验研究
    第四章 原核表达牛源斯钙素1重组蛋白研究
        摘要
        Abstract
        4.1 研究背景
        4.2 材料和方法
            4.2.1 实验动物
            4.2.2 试验材料和试剂
            4.2.3 克隆奶牛斯钙素1基因
            4.2.4 扩增产物的TA克隆
            4.2.5 构建STC-1原核表达载体
            4.2.6 STC-1融合蛋白诱导表达
        4.3 结果
            4.3.1 STC-1基因的扩增和克隆
            4.3.2 RCR和酶切检测重组质粒pMD18-STC-1和pET-STC-1
            4.3.3 重组质粒pET-STC-1 DNA测序
            4.3.4 SDS-PAGE电泳分析表达产物
        4.4 讨论
    第五章 斯钙素1蛋白在奶牛胃肠道差异性表达情况研究
        摘要
        Abstract
        5.1 研究背景
        5.2 材料与方法
            5.2.1 实验动物
            5.2.2 实验试剂
            5.2.3 仪器设备
            5.2.4 半定量Real-time PCR
            5.2.5 细胞蛋白提取及蛋白含量测定
            5.2.6 免疫印迹分析
            5.2.7 数据分析
        5.3 结果
            5.3.1 STC-1基因的扩增曲线和融解曲线
            5.3.2 总蛋白浓度测定
            5.3.3 STC-1基因在奶牛胃肠道和肾脏的表达情况
            5.3.4 STC-1蛋白在奶牛胃肠道和肾脏的表达情况
        5.4 讨论
    第六章 新生牛小肠上皮细胞培养方法建立
        摘要
        Abstract
        6.1 前言
        6.2 材料和方法
            6.2.1 实验试剂
            6.2.2 主要试验仪器和设备
            6.2.3 无菌操作
            6.2.4 分离小肠上皮细胞
            6.2.5 纯化小肠上皮细胞
            6.2.6 小肠上皮细胞形态学观察
            6.2.7 鉴定小肠上皮细胞
            6.2.8 PCR
        6.3 结果
            6.3.1 上皮细胞形态学观察
            6.3.2 电镜和染色观察上皮细胞
            6.3.3 免疫细胞化学鉴定上皮细胞
            6.3.4 PCR鉴定上皮细胞
        6.4 讨论
    第七章 斯钙素1对过氧化氢诱导的奶牛肠道上皮细胞损伤的保护作用研究
        摘要
        Abstract
        7.1 研究背景
        7.2 材料和方法
            7.2.1 实验试剂和材料
            7.2.2 主要仪器
            7.2.3 新生牛小肠上皮细胞培养
            7.2.4 构建pcDNA-STC-1重组质粒的
            7.2.5 细胞处理
            7.2.6 吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)双染色
            7.2.7 细胞存活率检测
            7.2.8 Real-timePCR基因表达分析
            7.2.9 Westem blotting
            7.2.10 数据分析
        7.3 实验结果
            7.3.1 转染细胞中STC-1表达情况
            7.3.2 H₂O₂诱导的细胞损伤
            7.3.3 H₂O₂诱导的细胞死亡
            7.3.4 H₂O₂诱导的STC-1表达
            7.3.5 STC-1超表达对H₂O₂诱导的损伤的作用
            7.3.6 STC-1超表达对凋亡相关蛋白表达的作用
        7.4 讨论
    第八章 斯钙素1对Caco₂细胞新型钙离子转运蛋白调节作用研究
        摘要
        Abstract
        8.1 研究背景
        8.2 材料和方法
            8.2.1 试验材料和试剂
            8.2.2 细胞培养
            8.2.3 构建重组表达质粒pIRES-STC-1
            8.2.4 STC-1基因siRNA设计和合成
            8.2.5 细胞处理和重组质粒和siRNA转染
            8.2.6 Real-time PCR
            8.2.7 Western blotting
            8.2.8 数据分析
        8.3 结果
            8.3.1 转染后Caco2细胞中STC-1表达情况
            8.3.2 STC-1超表达对Ca²⁺转运蛋白的影响
            8.3.3 STC-1表达抑制对Ca²⁺转运蛋白的影响
        8.4 讨论
参考文献
致谢
附录



本文编号：3911638