奶山羊乳腺组织乳脂代谢相关miRNAs的筛选及功能验证

发布时间：2024-05-25 05:28

　　山羊乳中总脂肪含量,尤其是其中与人类健康密切相关的中短链脂肪酸及不饱和脂肪酸含量均高于牛乳。山羊乳的乳脂特点应与其乳腺乳脂代谢密切相关。然而,在乳脂代谢基因中,至今尚未发现山羊特异性表达或者具有特异功能的基因。据此推测山羊乳脂代谢的特点可能与其在基因不同水平(如转录后、翻译水平)的调控机制有关。MicroRNAs (miRNAs)是一类在转录后水平调控基因表达的小分子RNA,其功能几乎涉及生命活动的各个方面。已证实miRNAs是调控脂肪和肝脏组织中脂肪代谢的重要因子,然而,现有研究缺乏(?)niRNAs调控山羊乳腺乳脂代谢的研究报道。因此,本研究从miRNAs调控乳腺乳脂代谢的角度出发,通过测序技术获得西农萨能奶山羊乳腺组织miRNAs表达谱,分析其序列特征,检测其在乳腺组织不同阶段的表达水平,筛选与山羊乳脂代谢相关的miRNAs,并通过在山羊乳腺上皮细胞(GMEC)中过表达miRNAs,检测细胞中与乳脂代谢相关的指标,证实miRNAs对山羊乳脂合成和组成具有重要影响,同时发现3对可在乳腺组织中协同表达的miRNAs,发现其协同调控山羊乳腺组织乳脂代谢。本研究从miRNAs调控角度阐明...

【文章页数】：140 页

【学位级别】：博士

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摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
    1.1 动物microRNAs(miRNAs)的生物学特征
        1.1.1 MiRNAs的生成
        1.1.2 MiRNAs的序列及功能特点
        1.1.3 MiRNAs调控下游基因表达的原理
        1.1.4 调控miRNAs表达的分子机制
    1.2 MiRNAs在动物生长、发育中的功能
        1.2.1 MiRNAs调控个体发育的功能
        1.2.2 MiRNAs调控哺乳动物组织发育的功能
        1.2.3 MiRNAs对乳腺发育的调控作用
    1.3 MiRNAs对脂质代谢的调控作用
        1.3.1 MiRNAs调控肝脏脂质代谢
        1.3.2 MiRNAs调控脂肪组织和细胞中的脂肪代谢
        1.3.3 MiRNAs调控其它组织和细胞中的脂质代谢
    1.4 乳腺组织乳脂代谢分子机制
        1.4.1 乳脂肪与其它组织中脂肪的区别
        1.4.2 山羊乳脂肪的组成特点及功能
        1.4.3 牛和小鼠乳腺组织乳脂代谢分子机制
        1.4.4 山羊乳脂代谢分子机制研究进展
    1.5 MiRNAs调控乳腺乳脂代谢分子机制研究进展
    1.6 本研究的目的意义
第二章 山羊乳腺组织miRNAs测序、生物信息学分析
    2.1 材料与方法
        2.1.1 主要试剂和仪器
        2.1.2 动物样品采集、总RNA提取
        2.1.3 Solexa测序
        2.1.4 山羊乳腺组织miRNAs的生物信息学鉴定
        2.1.5 山羊miRNAs特征分析
    2.2 结果
        2.2.1 总RNA样品检测结果
        2.2.2 Solexa测序结果质量鉴定及小RNAs序列分析
        2.2.3 山羊乳腺组织miRNAs序列分析
    2.3 讨论
        2.3.1 Solexa测序结果的质量
        2.3.2 山羊乳腺组织小RNAs长度分布与功能
        2.3.3 山羊miRNAs序列的生物信息学鉴定方法
        2.3.4 山羊保守miRNAs的序列特征
    2.4 小结
第三章 泌乳中期和干奶期山羊乳腺组织差异表达miRNAs的筛选及功能预测
    3.1 材料与方法
        3.1.1 主要试剂和仪器
        3.1.2 动物样品采集及总RNA提取
        3.1.3 MiRNA cDNA合成与定量PCR
        3.1.4 MiRNAs靶基因预测、GO富集和KEGG通路分析
        3.1.5 山羊乳腺上皮细胞的培养
        3.1.6 催乳素试验及细胞总RNA提取
    3.2 结果
        3.2.1 山羊乳腺组织泌乳中期和干奶期miRNAs表达分析
        3.2.2 差异表达miRNAs靶基因的功能预测
        3.2.3 调控山羊乳脂代谢miRNAs的筛选
    3.3 讨论
        3.3.1 MiRNAs在不同动物乳腺组织中的表达情况
        3.3.2 MiRNAs对乳腺发育和脂肪代谢的调控作用
        3.3.3 激素对miRNAs表达的调节作用
    3.4 小结
第四章 腺病毒介导的miRNAs在乳腺上皮细胞中的过表达研究
    4.1 材料与方法
        4.1.1 腺病毒载体构建所用试剂、材料和仪器
        4.1.2 细胞培养所用试剂、材料和仪器
        4.1.3 腺病毒载体构建
        4.1.4 腺病毒载体pAd-miRNAs在HEK293细胞株中的包装和扩繁
        4.1.5 病毒感染乳腺上皮细胞
        4.1.6 细胞核染色
    4.2 结果
        4.2.1 重组腺病毒质粒pAd-miRNAs的构建及鉴定
        4.2.2 pAd-miRNA包装和病毒扩繁
        4.2.3 腺病毒介导miRNAs在GMEC中的过表达
    4.3 讨论
    4.4 小结
第五章 MiR-103对山羊乳腺上皮细胞乳脂代谢的调控作用研究
    5.1 材料与方法
        5.1.1 主要试剂和仪器
        5.1.2 动物样品采集、总RNA提取
        5.1.3 CDNA合成及定量PCR
        5.1.4 脂滴油红O染色
        5.1.5 甘油三酯提取、含量测定
        5.1.6 脂肪酸提取、含量测定
        5.1.7 MiRNA inhibitor转染乳腺上皮细胞
        5.1.8 相关性分析
    5.2 结果
        5.2.1 细胞中脂滴形态观察结果
        5.2.2 甘油三酯含量测定结果
        5.2.3 脂肪酸含量分析结果
        5.2.4 乳脂生成相关基因mRNAs检测结果
        5.2.5 其它乳脂代谢相关基因表达量检测结果
        5.2.6 MiR-103表达量抑制试验
        5.2.7 MiR-1031与泛酸酶基因(PANK3)表达量的关联分析
    5.3 讨论
        5.3.1 研究miR-103调控乳脂合成功能的重要性
        5.3.2 MiR-103对脂肪脂解、β-氧化的调控作用
        5.3.3 MiR-103-1与PANK3
    5.4 小结
第六章 MiR-27a对山羊乳腺上皮细胞乳脂代谢的调控作用研究
    6.1 材料与方法
        6.1.1 主要试剂和仪器
        6.1.2 细胞总RNA提取、cDNA合成和定量PCR试验
        6.1.3 油红O染色、甘油三酯含量测定及脂肪酸提取
        6.1.4 Western blotting
    6.2 结果
        6.2.1 细胞中脂滴形态观察结果
        6.2.2 甘油三酯含量测定结果
        6.2.3 脂肪酸含量分析结果
        6.2.4 乳脂合成相关基因mRNAs定量检测结果
        6.2.5 PPARγ表达量检测结果
        6.2.6 脂肪分解和β-氧化相关基因表达量检测结果
    6.3 讨论
        6.3.1 MiR-27a对GMEC乳脂代谢的调控作用
        6.3.2 过表达miR-27a对不饱和脂肪酸/饱和脂肪酸比例的影响
        6.3.3 PPARγ对下游基因的调控作用
        6.3.4 GMEC中脂滴分布情况
    6.4 小结
第七章 MiR-23a和miR-200a在山羊乳腺上皮细胞中的功能研究
    7.1 材料与方法
        7.1.1 主要试剂和仪器
        7.1.2 动物样品采集、总RNA提取
        7.1.3 细胞总RNA提取、cDNA合成和定量PCR
        7.1.4 油红O含量与甘油三酯含量分析
        7.1.5 MiRNAs表达量之间的关联分析
    7.2 结果
        7.2.1 MiR-23a过表达对乳脂合成的影响
        7.2.2 MiR-200a对乳脂合成相关基因mRNA表达的影响
        7.2.3 协同表达miRNAs的鉴定
    7.3 讨论
        7.3.1 过表达miR-23a对乳脂合成的影响
        7.3.2 不同物种miR-200a的功能及其对GMEC乳脂代谢的影响
        7.3.3 乳脂代谢分子网络的初步建立
    7.4 小结
结论
本研究的创新点
存在问题及展望
参考文献
附录
缩略词表(Abbreviation)
致谢
作者简介



本文编号：3981770