柯萨奇病毒A2型的鉴定与手足口病乳鼠模型的构建

发布时间：2020-11-21 08:30

　　背景手足口病(hand-foot-mouth disease,HFMD)是由肠道病毒感染引起的常见小儿传染病。由于目前尚无有效的治疗方法,该病每年的发病率仍居我国丙类传染病之首,已成为严重影响婴幼儿健康的重要公共卫生问题。近年来,随着HFMD病原谱的演变,除常见的肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)和柯萨奇病毒A 16型(Coxsackievirus A 16,CVA16)外,柯萨奇病毒A 2型(Coxsackievirus A 2,CVA2)、柯萨奇病毒A 10型(Coxsackievirus A 10,CVA10)及柯萨奇病毒A 6型(Coxsackievirus A 6,CVA6)等新型肠道病毒感染病例逐渐增多。目前关于HFMD的研究多集中在EV71和CVA16,而CVA2方面的研究甚少报道。目的1.研究新乡医学院第一附属医院感染科HFMD的病原谱特征。2.鉴定临床来源的CVA2病毒株,并研究其体外毒力和对天然免疫信号的影响。3.构建CVA2感染乳鼠模型。方法1.采集2017年5月~8月在新乡医学院第一附属医院住院治疗的HFMD患儿粪便标本19例,用横纹肌肉瘤细胞(RD细胞)分离病毒并扩增,提取病毒RNA,逆转录后,使用肠道病毒VP1通用引物、EV71病毒和CVA16病毒VP1保守序列引物对cDNA进行扩增,产物送生工生物工程(上海)股份有限公司测序,并对测序结果进行比对。设计CVA2 VP1全长引物,对测序结果为CVA2的病毒cDNA(样品11-1)进行PCR扩增,同样克隆后测序,对获得的CVA2 VP1全长序列进行系统进化树分析。2.将样品11-1分离得到的CVA2病毒以MOI=0.1接种RD细胞,分别在感染后0、4、8、16、24、48 h检测CVA2 mRNA的表达量。将该CVA2病毒以MOI=0、0.1、0.25、0.5、1和2感染RD细胞,24 h后提取总RNA和蛋白,用荧光定量PCR方法检测细胞因子IFN-β1、IL-1β、IL-6以及凋亡相关基因Caspase-8、Caspase-9和Cyto C mRNA的表达水平,采用Western blot检测天然免疫信号相关蛋白RIG-I、MAVS、IRAK1、TRAF6、pTBK1和TBK1以及凋亡相关蛋白Caspase-3和Cleaved Caspase-3的表达水平。3.将CVA2以颅内注射的方式(1×10~6 pfu/小鼠)感染10只5日龄BALB/c乳鼠,记录乳鼠生存情况。对照组(Mock)组5日龄BALB/c乳鼠乳鼠颅内注射等体积RD细胞培养上清液。感染后第7天,分别取小鼠脑、肺、心脏、脾、骨骼肌、小肠、脾、肝和肾组织,4%多聚甲醛固定48小时后,采用苏木素-伊红(Hematoxylin-Eosin,HE)染色观察病理学改变。结果1.19例HFMD病例的病原体测序结果显示,其他肠道病毒、EV71、CVA16和CVA2的百分比分别为36.84%、10.53%、36.84%和15.79%。将19例样品的RT-PCR与测序结果比较显示7、11和12号样品PCR电泳结果与测序结果不一致,经进一步测序比对后发现,7、11和12号样品为CVA2型。2.RD细胞中CVA2 mRNA水平在CVA2感染后24 h和48 h均显著升高(P0.05)。同时,RD细胞中和炎症细胞因子IL-1β和IL-6 mRNA在CVA2感染后表达水平均显著升高(P0.05),而抗病毒基因IFN-β1 mRNA的表达水平显著降低(P0.05)。凋亡相关基因的检测结果显示,CVA2感染后,RD细胞中Caspase-8、Caspase-9的表达水平显著升高(P0.05),Cyto C mRNA的表达水平先上升后下降,凋亡蛋白Caspase-3表达水平降低,而Cleaved Caspase-3表达水平升高。天然免疫信号检测结果发现,CVA2感染后,RD细胞中RIG-I、MAVS和pTBK1表达量升高,而IRAK1和TRAF6表达量降低。3.乳鼠感染CVA2后出现明显的中枢神经系统症状。HE染色显示脑组织出现神经元退行性改变和炎症细胞浸润,肺组织出现充血、肿胀,表现为肺泡腔增大,肺间质增厚,并伴有大量红细胞和炎症细胞浸润。心肌组织表现心肌炎改变,表现为右心房扩张,房室壁增厚以及炎性细胞浸润。骨骼肌出现明显溶解和坏死,并伴炎症细胞浸润。小肠绒毛断裂,呈现不规则排列。肾脏和肝脏出现炎症细胞浸润。结论1.本论文研究所检测的19例HFMD患者的病原谱中,鉴定出了CVA2。2.本研究分离的CVA2毒株在体外可诱导细胞凋亡,并能够影响天然免疫信号转导。3.CVA2可通过颅内注射成功感染5日龄BALB/c乳鼠,引起乳鼠神经系统、肺部、骨骼肌和心肌病变。
【学位单位】：新乡医学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R725.1;R-332
【部分图文】：

细胞病变,样品

2 结果2.1 样品采集与鉴定结果2.1.1 样本病毒扩增正常 RD 细胞呈贴壁生长，RD 细胞感染肠道病毒后可出现 CPE 改变，表现为细胞变圆、脱落、折光性增加，并相互聚集。19 例确诊手足口病标本经 RD 细胞扩增 4代后，4、8、11、12、13 号样品可见明显 CPE 表现，7、9、10、15、17、18、19 号样品可见 CPE 表现，1、2、6、14 号样品 CPE 表现不明显，3、5、16 号样品未见明显 CPE 表现（图 1）。

RT-PCR扩增,引物,核酸,样本

样品病毒鉴定 RT-PCR 鉴定别用 PE、EV71 和 CVA16 三对核酸检测引物对 19 例样品分别进行 PC结果显示：4、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、17、18、19 和示 PE 核酸阳性；7、8、11、12、13 和 14 号样本显示 EV71 核酸阳性；15、16、17 和 18 号样本为 CVA16 核酸阳性，分别见图 2、3 和 4。

RT-PCR扩增,引物,核酸,手足口病

结果显示：4、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、17、18、19 和显示 PE 核酸阳性；7、8、11、12、13 和 14 号样本显示 EV71 核酸阳性；4、15、16、17 和 18 号样本为 CVA16 核酸阳性，分别见图 2、3 和 4。图 2：PE 引物 RT-PCR 扩增结果500 bp DNAMarker；1～19：手足口病；20：EV71 阳性对照；21：阴性
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