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纳米/微米球疫苗递送系统免疫佐剂效应的研究

发布时间:2022-11-12 17:33
  生物材料疫苗递送系统的免疫佐剂效应在增强抗原或免疫增强剂的免疫应答方面具有重要作用。较常规载体,纳米/微米球形颗粒疫苗递送系统可高效包载抗原及免疫增强剂,增强抗原稳定性,促进抗原递呈细胞(antigen presenting cell, APC)对抗原的胞吞,加工,促进抗原的交叉呈递,引起更强的体液免疫和细胞免疫反应。本课题以高分子生物材料为载体,负载抗原后构建抗原递送系统,研究其体内外的免疫反应与佐剂机制。研究内容包括以下三个方面:1)负载百日咳毒素(PTd)的PLGA纳米/微米球疫苗的制备及其免疫学机制研究。近年来,美国、澳大利亚、英国等国家,具高致病率、致死率的百日咳大量复发,研发有效预防百日咳新型疫苗具有重大意义。以FDA认证,具有良好生物相容性的聚乳酸-聚羟基乙酸(poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA)为载体,以脱毒百日咳毒素(Pertussis Toxin, PTd)为抗原,经双乳化法制备PTd PLGA纳米/微米球混合制剂(PTd PL ANP./MP.)。较裸抗原,PTd PLGA NP./MP疫苗制剂有效地促进了抗原被巨噬细胞的吞噬。... 

【文章页数】:127 页

【学位级别】:博士

【文章目录】:
摘要
ABSTRACT
第一章 引言
    1. 疫苗的发展
        1.1 疫苗的种类
            1.1.1 预防性疫苗
            1.1.2 治疗性疫苗
        1.2 疫苗的免疫应答
        1.3 疫苗免疫佐剂
    2. 纳米球作为疫苗载体的研究
        2.1 脂质体
        2.2 壳聚糖
        2.3 生物可降解性聚合物
            2.3.1 聚乳酸-羟基乙酸(poly(L-lactide-co-gly-colide),PLGA)
            2.3.2 聚乙烯亚胺(Polyethyleneimine,PEI)
            2.3.3 丙烯酸聚合物
    3. 疫苗递送系统的性质对免疫应答的影响
        3.1 球形颗粒粒径
        3.2 球形颗粒表面电荷
        3.3 纳米/微米球颗粒疏水性
        3.4 抗原与纳米/微米球疫苗递送载体的加载方式
    4. 纳米/微米球形疫苗载体佐剂效应的免疫学机制
        4.1 抗原储存
        4.2 APCs的摄取和活化
        4.3 溶酶体逃逸
        4.4 补体激活
    5. 课题的提出
第二章 负载百日咳毒素(PTd)的PLGA纳米/微米球(NP./MP.)作为疫苗的可行性及其免疫学机制研究
    1. 材料、仪器及动物
        1.1 材料
        1.2 仪器
        1.3 动物
    2. 实验方法
        2.1 PLGA纳米/微米球的制备及表征
            2.1.1 PLGA纳米/微米球的制备及表征
            2.1.2 PTd PLGA纳米/微米球内包封抗原浓度测定
        2.2 MTT法检测PTd NP./MP.的细胞毒性
        2.3 巨噬细胞J774.2对PLGA NP./MP.的内吞
            2.3.1 流式细胞术检测BSA(F1TC)NP./MP.的内吞
            2.3.2 激光共聚焦显微镜检测BSA(FITC)NP./MP.的内吞
            2.3.3 激光共聚焦显微镜检测PTd.NP./MP.的内吞
        2.4 PTd NP./MP.的免疫反应评价
            2.4.1 小鼠血清制备及特异性抗PT抗体IgG滴度检测
            2.4.2 特异性抗PT抗体IgG亚型检测
            2.4.3 小鼠脾脏淋巴细胞的分离及细胞因子检测
            2.4.4 巨噬细胞分离及NO分泌的检测
        2.5 统计分析
    3. 结果
        3.1 PLGA纳米/微米球的粒径,电位,表面形貌及包封抗原浓度
        3.2 PTd NP./MP.的体外细胞毒性
        3.3 J774.2细胞对PLGA NP./MP.的内吞
            3.3.1 J774.2细胞对BSA(FITC)NP./MP.的内吞
            3.3.2 J774.2细胞对PTd(FITC)NP./MP.的内吞
        3.4 PTd NP./MP.的免疫应答
            3.4.1 皮下免疫
            3.4.2 皮内免疫接种PTd NP./MP
                3.4.2.1 特异性抗百日咳毒素抗体IgG
                3.4.2.2 特异性IgG亚型检测
                3.4.2.3 细胞因子的释放
                3.4.2.4 巨噬细胞分泌的NO
        3.5 PTd NP./MP.皮下与皮内免疫应答的比较
    4. 本章小结
第三章 新型酸敏感型阳离子纳米球PEDG作为疫苗递送载体的可行性及免疫机制研究
    1. 材料,仪器及动物
        1.1 材料
        1.2 仪器
        1.3 动物
    2. 实验方法
        2.1 mPEG-b-PDPA-b-PGEM的合成
            2.1.1 mPEG-b-PDPA-b-PtBAM的合成
            2.1.2 mPEG-b-PDPA-b-PGEM的合成
        2.2 PEDG聚合物的表征,空白纳米粒及Nano.-OVA的制备
        2.3 PEDG酸性敏感性测定及Nanno.-OVA的抗原释放
        2.4 骨髓粒细胞的提取及BMDCs的诱导,分离及鉴定
        2.5 PEDG NPs对BMDCs的促成熟作用
        2.6 BMDCs对Nanno.OVA的捕获
        2.7 Nanno.OVA体外对BMDCs及巨噬细胞Raw 264.7的活化作用
        2.8 BMDCs对Nanno.OVA的体外交叉提呈
        2.9 体内追踪罗丹明标记的抗原
        2.10 动物免疫及不同OVA剂型的体内免疫应答
            2.10.1 特异性抗体应答检测
            2.10.2 特异性抗OVA抗体IgG亚型检测
            2.10.3 小鼠脾脏淋巴细胞的分离及细胞因子检测
        2.11 抗原的体内提呈
        2.12 统计分析
    3. 结果
        3.1 PEDG聚合物的合成和物理特性
        3.2 PEDG对抗原OVA的包封及其酸敏感性
        3.3 抗原被BMDCs的捕获及其胞内定位
        3.4 PEDG纳米球促BMDCs及巨噬细胞Raw 264.7的成熟与活化
        3.5 PEDG纳米球促进抗原的体外交叉提呈
        3.6 抗原的体内迁移
        3.7 Nano.-OVA的体内获得性免疫应答
        3.8 抗原的体内交叉提呈
    4. 本章小结
第四章 阳离子纳米载体佐剂作用的机制研究
    1. 材料、仪器及动物
        1.1 材料
        1.2 仪器
        1.3 动物
    2. 实验方法
        2.1 PEC、PECG-1、PECG-2共聚物的合成,表征及纳米球的制备
        2.2 BMDCs的提取及体外诱导
        2.3 BMDCs对PEC、PECG-1、PECG2 NPs的吞噬
        2.4 PEC、PECG-1、PECG-2 NPs对BMDCs的促成熟作用
        2.5 PEC、PECG-1、PECG-2 NPs对抗原体外交叉提呈的影响
        2.6 PEC、PECG-1、PECG-2 NPs在体内对外源抗原的滞留及回流淋巴结的迁移
        2.7 PEC、PECG-1、PECG-2 NPs的体内免疫应答
    3. 结果与讨论
        3.1 不同表面电荷纳米球的合成及物理特性
        3.2 纳米球表面电荷对BMDCs捕获的作用
        3.3 PEC、PECG-1、PECG-2 NPs促BMDCs成熟
        3.4 纳米球表面电荷越多更能刺激抗原的体外交叉提呈
        3.5 表面电荷对纳米球体内迁移的作用
        3.6 纳米球表面电荷对其体内应答的作用
    4. 本章小结
参考文献
全文总结
作者简历
致谢


【参考文献】:
期刊论文
[1]Dendritic cell-based vaccine for pancreatic cancer in Japan[J]. Masato Okamoto,Masanori Kobayashi,Yoshikazu Yonemitsu,Shigeo Koido,Sadamu Homma.  World Journal of Gastrointestinal Pharmacology and Therapeutics. 2016(01)
[2]Innate immunity and hepatocarcinoma: Can toll-like receptors open the door to oncogenesis?[J]. Jorge André Gomes Lopes,Marta Borges-Canha,Pedro Pimentel-Nunes.  World Journal of Hepatology. 2016(03)



本文编号:3706785

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