结核分枝杆菌氨酰tRNA合成酶催化机制研究

发布时间：2023-03-11 02:41

　　结核病(TB)是由结核分枝杆菌引起的严重感染性疾病,是全球十大死因之一。据WHO的报告,2016年全球有1,040万人患有结核病。其中,儿童感染者为100万。170万人死于该病(其中40万人患有艾滋病毒)。抗生素在结核病治疗中的长期使用,引起耐药结核菌感染病例增多。2016年,世界范围内估计新增60万例多重耐药结核菌感染病例,为结核病的防治工作带来前所未有的严峻挑战。因此,发现新的药物靶点和设计新型抗结核药物迫在眉睫。氨酰tRNA合成酶(aminoacyl-tRNAsynthetases,aaRS)作为细胞内高度保守蛋白酶家族,参与到生物遗传信息翻译过程中,负责将氨基酸转移到对应的tRNA上,是确保细胞内遗传信息忠实翻译的酶。根据结构与模序(motif)的差异,aaRS被分为两类,每一类由10种酶组成。在所有的20种氨酰tRNA合成酶中,MetRS的生物学作用最为重要。它不仅识别初始tRNA,同时参与蛋白质肽链的延伸。除此之外,不同物种来源的MetRS具有结构上的多样性。在近几年的aaRS抑制剂研究中,发现了一些氨酰tRNA合成酶抑制剂,具有高选择性和强抑制能力。aaRS已被证明是理想...

【文章页数】：105 页

【学位级别】：博士

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中文摘要
Abstract
引言
    1 氨酰tRNA合成酶在生命中的功能
    2 氨酰tRNA合成酶的进化
    3 氨酰tRNA合成酶抑制剂的研究现状
    4 甲硫氨酰tRNA合成酶研究现状
本课题拟解决的科学问题
本课题研究内容和意义
    1 重组蛋白的获得和生化研究
    2 结核分枝杆菌MetRS的晶体学研究
    3 结核分枝杆菌MetRS的结构分析及突变验证
第一章 结核分枝杆菌MetRS重组蛋白质的制备和生化研究
    1.1 材料与仪器
        1.1.1 材料
        1.1.2 仪器
    1.2 方法
        1.2.1 MetRS氨基酸序列分析
        1.2.2 MetRS基因的克隆
        1.2.3 MetRS重组蛋白的表达筛选
        1.2.4 MetRS重组蛋白的纯化
        1.2.5 重组蛋白质的活性测定
        1.2.6 MetRS酶反应动力学分析
    1.3 结果
        1.3.1 MetRS的多序列比对及聚类分析
        1.3.2 结核分枝杆菌MetRS重组表达载体的构建筛选
        1.3.3 结核分枝杆菌MetRS重组蛋白的制备
        1.3.4 结核分枝杆菌MetRS重组蛋白质的活性鉴定
        1.3.5 底物甲硫氨酸K_m常数
        1.3.6 底物ATP K_m常数
        1.3.7 MetRS酶反应动力学比较
    1.4 讨论
第二章 结核分枝杆菌MetRS晶体学研究
    2.1 材料与仪器
    2.2 方法
        2.2.1 MetRS配体选择
        2.2.2 晶体生长条件筛选
        2.2.3 晶体生长条件优化
        2.2.4 晶体的冻存条件优化
        2.2.5 晶体数据收集
        2.2.6 晶体数据处理和结构的解析
    2.3 结果
        2.3.1 FTS实验结果
        2.3.2 Unligend MtMetRS结晶及衍射
        2.3.3 MtMetRS:Met-AMP复合物结晶及衍射
        2.3.4 衍射数据的处理及结构优化
    2.4 讨论
第三章 结核分枝杆菌MetRS结构分析及验证
    3.1 材料与仪器
    3.2 方法
        3.2.1 MtMetRS结构分析
        3.2.2 MetRS分子模型分析
        3.2.3 突变体实验
    3.3 结果
        3.3.1 不同物种MetRS的比较
        3.3.2 MtMetRS整体结构模型
        3.3.3 底物诱导的MetRS构象变化
        3.3.4 MetRS结合中间产物的差异
        3.3.5 MetRS保守性分析
        3.3.6 MetRS核酸结合环的稳定性分析
        3.3.7 MtMetRS疏水表面分析
        3.3.8 突变实验分析
    3.4 讨论
结论
参考文献
附录 缩略词表
致谢
个人简历及发表文章



本文编号：3759037