新型初级纤毛标记和生物传感器转基因动物的建立与分析
发布时间：2023-08-26 04:57
纤毛是细胞表面突起的亚细胞区域,根据轴丝微管骨架结构9+2和9+0的差别可分为运动纤毛和初级纤毛(Primary Cilium,PC)[1]。PC因不含有中央微管轴丝,所以不具有运动功能。PC广泛存在于脊椎动物细胞中,研究显示每个细胞有且仅有一根PC[2]。研究证明PC参与多个细胞信号转导途径的调控,如Hedgehog(Hh)、PDGF和WNT信号通路的调控[3]。Hh信号通路是一个在脊椎动物中高度保守的信号转导通路,在动物早期胚胎发育、形态建成以及个体物质能量代谢稳态维持中发挥着重要作用[4]。然而目前对PC在调节Hh通路信号转导的分子机制并不明确。我们前期研究认为PC中的PKA活性可能是调控Hh信号传导的关键,对该假设的验证需要能够在细胞层面监控PC中PKA活性以及其它细胞内可能参与信号传导的分子,如Ca2+等。然而目前对PC区域内信号分子检测缺乏有效的研究方法和研究材料,使得无法精细解析PC在调控Hh信号通路作用以及与PC相关其他信号通路的分子机制。为了解决上述研究的瓶颈...
【文章页数】：70 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
中文摘要
ABSTRACT
第一章 综述
1.1 纤毛
1.1.1 纤毛的结构和功能
1.2 初级纤毛(Primary Cilium)
1.3 Hedgehog信号通路
1.4 初级纤毛和Hedgehog信号通路的关系以及Hh通路研究的难点
1.5 FRET检测PKA活性的研究情况
1.6 斑马鱼模式动物
1.7 本研究的内容和意义
第二章 zNPHP3 N端肽段作为初级纤毛定位信号肽的功能验证
引言
2.1 材料与方法
2.1.1 实验材料
2.1.2 实验试剂
2.1.3 实验仪器
2.1.4 实验方法
2.1.4.1目的基因克隆实验
2.1.4.2胶回收实验
2.1.4.3 Gibson Assembly连接反应
2.1.4.4 测序结果分析与质粒提取
2.1.4.5 体外转录
2.1.4.6 显微注射
2.1.4.7 胚胎免疫荧光染色
2.2 实验结果
2.2.1 斑马鱼zNphp3 基因的生物信息学分析
2.2.2 斑马鱼全长蛋白z Nphp3 和截短多肽zNphp3N的亚细胞定位情况
2.2.2.1 斑马鱼zNphp3 全长蛋白可以定位初级纤毛
2.2.2.2 斑马鱼zNphp3N截短多肽可以定位初级纤毛
2.3 讨论
第三章 稳定转基因品系的构建及品系鉴定
引言
3.1 材料与方法
3.1.1 实验材料
3.1.2 主要试剂
3.1.3 主要仪器
3.1.4 引物设计
3.1.5 实验方法
3.1.5.1 载体构建
3.1.5.2 遗传筛选
3.1.5.3 胚胎免疫荧光染色
3.1.5.4 原位杂交
3.2 实验结果
3.2.1 获得稳定斑马鱼转基因品系
3.2.3 稳定斑马鱼转基因品系初级纤毛的标记情况
3.2.3.1 稳定斑马鱼转基因品系初级纤毛成功标记mCherry和 AKAR
3.2.4 原位杂交实验结果
3.2.4.1 原位杂交探针ptch2在AB型与转基因斑马鱼中的表达信息
3.2.4.2 原位杂交探针olig2在AB型与转基因斑马鱼中的表达信息
3.3 讨论
第四章 AKAR2 的功能验证
引言
4.1 材料与方法
4.1.1 主要试剂
4.1.2 主要仪器
4.1.3 实验方法
4.2 实验结果
4.2.1 PKA生物传感器建立成功
4.2.2 PKA在 Hh信号通路中的功能分析
4.3 讨论
第五章 Hh通路异常疾病Gorlin综合症致病机制的研究
引言
5.1 研究对象与实验方法
5.1.1 研究对象
5.1.2 实验方法
5.1.2.1 临床病例分析
5.1.2.2 血液基因组DNA的提取
5.1.2.3 全外显子测序
5.1.2.4 Sanger测序验证突变位点
5.2 实验结果
5.2.1 临床病理特征分析
5.2.2 先证者的家系图
5.2.3 家系成员PTCH1 突变的鉴定
5.3 讨论
参考文献
攻读学位期间取得的研究成果
致谢
个人简况及联系方式
本文编号：3844001
【文章页数】：70 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
中文摘要
ABSTRACT
第一章 综述
1.1 纤毛
1.1.1 纤毛的结构和功能
1.2 初级纤毛(Primary Cilium)
1.3 Hedgehog信号通路
1.4 初级纤毛和Hedgehog信号通路的关系以及Hh通路研究的难点
1.5 FRET检测PKA活性的研究情况
1.6 斑马鱼模式动物
1.7 本研究的内容和意义
第二章 zNPHP3 N端肽段作为初级纤毛定位信号肽的功能验证
引言
2.1 材料与方法
2.1.1 实验材料
2.1.2 实验试剂
2.1.3 实验仪器
2.1.4 实验方法
2.1.4.1目的基因克隆实验
2.1.4.2胶回收实验
2.1.4.3 Gibson Assembly连接反应
2.1.4.4 测序结果分析与质粒提取
2.1.4.5 体外转录
2.1.4.6 显微注射
2.1.4.7 胚胎免疫荧光染色
2.2 实验结果
2.2.1 斑马鱼zNphp3 基因的生物信息学分析
2.2.2 斑马鱼全长蛋白z Nphp3 和截短多肽zNphp3N的亚细胞定位情况
2.2.2.1 斑马鱼zNphp3 全长蛋白可以定位初级纤毛
2.2.2.2 斑马鱼zNphp3N截短多肽可以定位初级纤毛
2.3 讨论
第三章 稳定转基因品系的构建及品系鉴定
引言
3.1 材料与方法
3.1.1 实验材料
3.1.2 主要试剂
3.1.3 主要仪器
3.1.4 引物设计
3.1.5 实验方法
3.1.5.1 载体构建
3.1.5.2 遗传筛选
3.1.5.3 胚胎免疫荧光染色
3.1.5.4 原位杂交
3.2 实验结果
3.2.1 获得稳定斑马鱼转基因品系
3.2.3 稳定斑马鱼转基因品系初级纤毛的标记情况
3.2.3.1 稳定斑马鱼转基因品系初级纤毛成功标记mCherry和 AKAR
3.2.4 原位杂交实验结果
3.2.4.1 原位杂交探针ptch2在AB型与转基因斑马鱼中的表达信息
3.2.4.2 原位杂交探针olig2在AB型与转基因斑马鱼中的表达信息
3.3 讨论
第四章 AKAR2 的功能验证
引言
4.1 材料与方法
4.1.1 主要试剂
4.1.2 主要仪器
4.1.3 实验方法
4.2 实验结果
4.2.1 PKA生物传感器建立成功
4.2.2 PKA在 Hh信号通路中的功能分析
4.3 讨论
第五章 Hh通路异常疾病Gorlin综合症致病机制的研究
引言
5.1 研究对象与实验方法
5.1.1 研究对象
5.1.2 实验方法
5.1.2.1 临床病例分析
5.1.2.2 血液基因组DNA的提取
5.1.2.3 全外显子测序
5.1.2.4 Sanger测序验证突变位点
5.2 实验结果
5.2.1 临床病理特征分析
5.2.2 先证者的家系图
5.2.3 家系成员PTCH1 突变的鉴定
5.3 讨论
参考文献
攻读学位期间取得的研究成果
致谢
个人简况及联系方式
本文编号：3844001
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