缺氧诱导巨噬细胞来源外泌体的提取与鉴定

发布时间：2024-04-27 19:40

　　目的 分析缺氧诱导巨噬细胞分泌产生外泌体，并对外泌体的形态特征进行分析鉴定。方法 首先采用佛波酯诱导THP-1细胞促使其分化成为巨噬细胞，分别收集缺氧干预0,12,24 h的巨噬细胞源性外泌体，通过BCA方法提取外泌体蛋白，使用Western blot方法测定分析外泌体阴性对照蛋白Histone和外泌体表面标志蛋白CD63和HSP70的表达。利用透射电子显微镜及Nanosight NS300仪分析外泌体的形态、特征及粒径大小。结果 与缺氧干预0 h及12 h相比，缺氧干预24 h所得的巨噬细胞源性外泌体蛋白含量、CD63及HSP70的表达升高(P<0.05),而三组外泌体中均未检出Histone蛋白。外泌体呈形态均一的类圆形，表面有完整的双层模型结构，大多数外泌体颗粒的粒径集中在154 nm左右。结论 成功从缺氧干预巨噬细胞的细胞培养上清液中分离提取出外泌体，通过检测其特异性标志蛋白及形态学分析显示提取的外泌体含量及纯度较高。

【文章页数】：5 页

【部分图文】：

图1PMA诱导THP-1细胞分化成巨噬细胞(×100)

以不同蛋白标准品的浓度为横坐标，将各浓度蛋白标准品在568nm处的吸光度值作为纵坐标绘制标准曲线，根据标准曲线计算出待测外泌体的浓度(见图2)。结果显示，缺氧0,12,24h干预条件下，所得的20ml细胞上清培养液分别提取的外泌体蛋白浓度约为(3.22±0.22)mg/ml....

图2BCA标准曲线检测外泌体蛋白浓度

图1PMA诱导THP-1细胞分化成巨噬细胞(×100)2.3缺氧诱导巨噬细胞外泌体的标记蛋白表达

图3外泌体中HSP70、CD63、Histone蛋白水平随时间的变化

CD63、HSP70在各种细胞的外泌体中均有表达，是外泌体特征性的标记蛋白，而Histone作为外泌体的阴性对照蛋白。本研究经Westernblot分析显示，缺氧干预巨噬细胞分泌的外泌体中存在HSP70、CD63蛋白表达(见图3),而Histone蛋白无表达。缺氧0h与缺氧1....

图4外泌体的形态特征

透射电子显微镜结果显示，缺氧诱导巨噬细胞分泌的外泌体呈形态均一的类圆形，表面有完整的双层模型结构，其内部含有低密度物质，多呈单个散状分布(见图4A)。采用NTA检测系统进一步分析外泌体颗粒的粒径大小，结果显示，外泌体的粒径集中在(150±44)nm,大多数外泌体颗粒的粒径集中在....

本文编号：3965625