基于CRISPR/Cas9构建Msx1-Cre小鼠模型

发布时间：2024-06-29 07:33

　　目的:构建肌节同源盒基因1(Msx1)-Cre小鼠模型。方法:基于CRISPR/Cas9技术,设计靶向切割Msx1基因启动子下游的单链向导RNA(sgRNA),并构建包含Cre序列的同源重组片段;构建sg RNA载体质粒,转染至小鼠胚胎成纤维细胞(NIH3T3),并在细胞水平验证sg RNA的打靶效率和脱靶情况;将靶向切割Msx1基因的sg RNA、Cre同源重组片段及Cas9蛋白等混合溶液经体外显微注射至C57BL/6J小鼠的受精卵,3周后获得小鼠,利用PCR技术鉴定获得的F0代Msx1-Cre小鼠,并将构建成功的Msx1-Cre模型小鼠与Rosa26R-mTmG模型小鼠交配,进行功能验证。结果:设计的sg RNA能够有效定点切割Msx1基因启动子下游靶位点;成功获得Msx1-Cre小鼠模型; Msx1-Cre模型小鼠与Rosa26R-mTmG模型小鼠交配,子代小鼠免疫荧光结果显示,小鼠绿色荧光蛋白(GFP)特异定位于表达MSX1细胞的细胞膜上。结论:成功构建了Msx1-Cre小鼠模型,可用于示踪Msx1基因以及在表达MSX1的牙间充质细胞中进行条件性敲除或过表达实验来研究牙发育过程...

【文章页数】：5 页

【部分图文】：

图5Msx1-CreF0代小鼠基因型及功能鉴定

在患有Wolf-Hirschhorn综合征(又称4p-综合征)的先天性缺牙患者中发现其MSX1基因大片段缺失，且有关研究发现MSX1基因在颌面部发育过程中发挥着重要作用，MSX1基因完全缺失不仅会导致切牙不发育，磨牙发育停止在蕾状期，且伴随颅面部发育缺陷[14-15]。CRISP....

图1CRISPR/Cas9介导的Cre基因插入策略图

根据CRISPR/Cas9系统中sgRNA切割原理[7],sgRNA选择在Msx1基因的ATG后尽量靠近ATG位点。在CRISPR设计网站(https://sg.idtdna.com)上选择打靶分数高且脱靶率低的sgRNA序列。如图1所示，5’端同源臂从ATG起始密码子前开....

图2构建Msx1sgRNA的表达载体

如图2A，设计并合成的两段互补sgRNA序列退火成双链后，在T4连接酶参与的连接反应下接入被BsmBI双酶切的LentiCRISPRv2质粒上，测序结果显示sgRNA成功插入质粒，如图2B所示。提取成功构建的sgRNA载体质粒，进一步通过脂质体转染到NIH3T3细胞中，....

图3sgRNA转染NIH3T3细胞打靶验证

图2构建Msx1sgRNA的表达载体2.2F0代小鼠的获得鉴定及功能验证

本文编号：3997372