基于中空介孔二氧化硅的纳米药物载体的制备、表征及生物应用
【摘要】 恶性肿瘤（亦称癌症），严重威胁着人类的健康。在癌症的治疗中，药物治疗是一个很重要的环节，抗癌药物的有效使用可以帮助患者获得更长的生存时间。抗癌药物的研发一直是科学家关注的焦点之一，但是许多抗癌药物的溶解性低、稳定性差、易被快速代谢和清除、有副作用、缺少靶向功能等，在治疗的过程中很难充分发挥药效。若将药物包埋在药物载体中或者修饰在药物载体的表面，不但可以在一定程度上避免上述缺点，而且可以调节药物的释放速度，增加生物膜的通透性，改变药物在体内的分布使药物分子实现精确定位，从而提高药物的利用率。理想的药物载体应具有载药量大、化学性质稳定、低毒或无毒、可生物降解、在体内有一定的循还时间等特点。相比于传统的有机药物载体，无机药物载体有更高的药物包载率，更好的化学稳定性和生物相容性，因而更适合作药物载体。在众多的无机纳米材料中，介孔二氧化硅纳米颗粒由于具有大的比表面积、大的介孔体积、良好的生物相容性，并且可以进行功能化修饰等特点，已经越来越吸引人们的注意。近年来，很多科学家致力于改善介孔二氧化硅的结构性质，特别是扩大孔体积，进而有效地提高药物装载率。在介孔二氧化硅的内部引入中空的腔是扩大介孔二氧化硅孔装载体积最有效的方法。中空介孔二氧化硅不但具备介孔二氧化硅的所有优点，而且它的空腔大小和厚度可调，可以通过改变中空介孔二氧化硅的结构来调节药物的装载量及释放速度，并不需要进行复杂的化学修饰。本论文用不同的方法制备了中空介孔二氧化硅纳米颗粒，在载药和治疗方面做了研究和应用。基于这个研究方向，具体开展了以下的工作：第一章：综述了硅基纳米载体在生命科学中的研究应用。对介孔二氧化硅和中空介孔二氧化硅的制备和在药物载体方面的应用做了总结。第二章：以十六烷基三甲基溴化铵作介孔模板剂，金纳米颗粒作硬模板，制备了一系列空腔大小相同、介孔二氧化硅壳层厚度不同和介孔二氧化硅壳层厚度相同、空腔大小不同的中空介孔二氧化硅。在制备过程中首先将介孔模板剂通过煅烧的方法除去，然后将金纳米颗粒通过腐蚀的方法除去，这样既能保证将介孔模板完全除去，又能维持中空结构的完整性。该方法制备的中空介孔二氧化硅大小均匀，空腔明显，结构可调，分散性良好，细胞毒性小，是良好的纳米药物载体。本章分别研究了中空介孔二氧化硅对抗癌药物阿霉素的装载量以及阿霉素的释放速度与载体结构之间的关系。另外，还研究了不同的除模板方式得到的中空介孔二氧化硅的载药能力的区别。实验结果表明，中空介孔二氧化硅的载药量和药物的释放速度均与药物载体的结构有关，并且药物释放是厚度控制的释放。第三章：以二氧化硅实心球为硬模板，制备了中空介孔二氧化硅纳米颗粒。通过静电作用，在中空介孔二氧化硅的表面包覆两种单链DNA作为药物载体的阀门。这两种DNA分别与两种重要的肿瘤标志物TK1mRNA和GalNAc-T mRNA完全互补配对。由于TK1mRNA和GalNAc-T mRNA在癌细胞中均过表达，会分别与上述两种DNA互补配对形成双链，进而使药物载体的阀门同时打开，引发药物释放。由于一些肿瘤标志物在某些正常细胞中也是过表达的，因此一种DNA阀门会引起药物不预期的释放，而两种DNA阀门可以在很大程度上避免这种结果。结合中空介孔二氧化硅载药量大，生物相容性好的特点，预计可以更有效地杀伤癌细胞，而对正常细胞没有伤害，这在癌症的治疗中是非常有意义的。
第一章 前言
1.1 纳米材料概述
1.1.1 纳米材料简介
纳米科学与技术，简称为纳米技术（Nanotechnology）[1-5]是研讨 0.1-100 nm尺寸范围内的材料的性质及运用的一门科学技术。纳米技术以许多现代先进的科学技术为基础，是交叉性和综合性很强的学科，研讨内容非常广泛。纳米技术的研讨方向首要包含：纳米医学、纳米物理学、纳米化学、纳米材料学、纳米生物学、纳米电子学、纳米机械学、纳米加工学、纳米力学等等。其间，纳米材料的制备和研讨是纳米科技展开的基础。
纳米材料[4,6,7]是纳米级结构材料的简称，广义上是指构成物质的三维空间中至少有一维处于纳米尺度范围（1-100 nm，属于胶体粒子大小的范畴）或者由该尺度范围的物质为基本结构单元的一类材料。纳米材料按照纳米晶体几何结构的不同可以分为四类：① 零维纳米材料：具有原子簇和原子束结构的纳米材料（纳米颗粒）；② 一维纳米材料：具有纤维结构的纳米材料（纳米管或纳米纤维）；③ 二维纳米材料：具有层状结构的纳米材料（纳米薄膜）；④ 三维纳米材料：晶粒尺寸至少在一个方向上处于几纳米范围内的纳米材料（纳米块体）。如图 1-1 所示:
按照构成纳米材料的材质的不同，纳米材料可以分为金属纳米材料，如纳米金、纳米银；无机纳米材料，如二氧化硅纳米颗粒；有机纳米材料，如环糊精纳米管等等。
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1.2 介孔纳米材料概述
1.2.1 介孔纳米材料简介
IUPAC[40]规则，多孔资料能够分为三类：微孔资料（孔径小于 2 nm）、介孔资料（孔径介于 2 nm 和 50 nm 之间）、大孔资料（孔径大于 50 nm）。介孔资料的比表面积比大孔资料大的多，而且其孔径比微孔资料大，因此在催化、载药、别离等方面有较广泛的使用[41]。依照化学组成的不一样分类，介孔资料可分为硅基介孔资料和非硅基介孔资料两大类。构成硅基介孔资料的骨架的主要成分是硅酸盐和硅铝酸盐，如介孔二氧化硅等。构成非硅基介孔资料的骨架主要成分为不含硅的单质、氧化物或金属等，如介孔碳等。依据介孔资料构造的不一样，介孔资料能够分为两类：无序介孔资料（无定形）和有序介孔资料（一定程度有序）[42]。
无机介孔材料是目前研究最为广泛的介孔材料，在合成过程中主要应用溶胶-凝胶、乳化或微乳等化学原理，以表面活性剂为模板，通过有机物和无机物之间的界面相互作用而生成。这种原理制备的介孔材料具有孔道结构规则，孔径分布范围窄且大小可调，热稳定性和水热稳定性好，颗粒形貌规则等优点[42]。
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第二章 中空介孔二氧化硅的可控制备及生物应用
摘要：本章以十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）作介孔模板剂，金纳米颗粒（AuNPs）作硬模板，制备了一系列空腔大小相同、介孔二氧化硅壳层厚度不同和介孔二氧化硅壳层厚度相同、空腔大小不同的中空介孔二氧化硅纳米颗粒（HMSN）。首先将 CTAB 介孔模板通过煅烧的方法除去，然后将金纳米颗粒通过腐蚀的方法除去，这样既能保证将 CTAB 介孔模板完全除去，又能维持中空结构的完整性。该方法制备的 HMSN 大小均匀，空腔明显，结构可调，分散性良好，细胞毒性小，是良好的纳米药物载体。本章分别研究了 HMSN 对抗癌药物阿霉素（Dox）的装载能力以及装载到 HMSN 中的 Dox 的释放速度与材料结构之间的关系。另外，还对不同的除模板方式制备的 HMSN 的载药能力进行了研究。实验结果表明，HMSN 的载药量和装载物的释放速度均与药物载体的结构有关，其中药物释放是厚度控制的释放。
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2.1 引言
癌症（Cancer），亦称恶性肿瘤（Malignant neoplasm），是严重威胁人类健康的疾病之一。在癌症的治疗过程中，药物治疗是很重要的环节，抗癌药物的有效使用可以帮助患者获得更长的生存时间。研发新的抗癌药物一直是科学家关注的焦点，但是许多抗癌药物由于具有溶解性低、稳定性差、易被快速代谢和清除、有副作用、缺少靶向功能等缺点，在治疗的过程中很难充分发挥药效。若将药物包埋在药物载体中或者修饰在药物载体的表面，不但可以在一定程度上避免上述缺点，而且可以调节药物的释放速度，增加生物膜的通透性，改变药物在体内的分布使药物分子实现精确定位，从而提高药物的利用率[1-4]。理想的药物载体应具有载药量大、化学性质稳定、低毒或无毒、可生物降解、在体内有一定的循还时间等特点。纳米技术与先进的药物技术结合引导建立了新型的“纳米医药”领域，近年来越来越受关注[5]。纳米药物载体是纳米级微观范畴的亚微粒药物载体输送系统，其最大的优势是能够直接将药物分子运送到细胞中，通过被动或主动靶向功能穿过正常组织将药物运送到肿瘤等病变组织，集中杀伤病变的组织或细胞，并减小对正常组织的伤害，从而提高治疗效果。比较常见的纳米药物载体有水溶性的纳米聚合物，纳米脂质体，聚合物胶束，病毒，无机纳米载体等[2,5,6]，如表 2-1所示。尺寸和化学性质是纳米药物载体两个重要的选择因素，选择合适的药物载体可以提高在血液中的循环时间，避免网状内皮系统的的清除作用，使药物能更好地发挥全身治疗或诊断作用，增强药物在病变部位的治疗效果[5]。
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第三章 以 DNA 为阀门的中空介孔二氧化硅用于癌细胞的治疗.............. 73-87
摘要................................................. 73
3.1 引言 .....................73-76
3.2 实验部分...................... 76-80
3.2.1 仪器与试剂 ......................76-77
3.2.2 实验方法.............. 77-80
3.2.2.1 中空介孔二氧化硅纳米颗粒的制备.............. 77-78
3.2.2.2 HMSN (RhB)的制备................... 78
3.2.2.3 单链 DNA 寡核苷酸序列的设计合成 ..............78-79
3.2.2.4 HMSN (RhB)-DNA 的制备.............. 79
3.2.2.5 激光共聚焦成像............... 79-80
3.3 结果与讨论
3.3.1 HMSN 纳米材料的表征
HF 能够和二氧化硅反响生成可溶的四氟化硅，因此常用来刻蚀玻璃。本章中制备的 SiO2-NH2@SiO2纳米颗粒的 SiO2核是氨基化的，内部结构对比疏松，因此能够由氨基介导 HF 进入二氧化硅的核，然后腐蚀二氧化硅的核，并且在二氧化硅的壳层腐蚀出介孔孔道。
我们利用 JEM-100CX Π 型透射电镜（TEM）对制备的 HMSN 纳米颗粒的形貌进行了表征，首先将 HMSN 溶解于适量的水中，超声分散均匀后，用合适的铜网捞取样品，干燥后用透射电子显微镜观察形貌并拍照。从 HMSN 的透射电镜图中可以看出 HMSN 呈球形，大小比较均匀，大约在 150 nm 左右，分散均匀，空腔大小明显，如图 3-5 所示。
茚三酮是一种有机化合物，当该物质遇到氨、一级胺或二级胺时，会与它们发生化学反应，溶液变成蓝紫色，因此茚三酮常用来检测氨基酸。为了验证 HMSN表面的氨基存在，我们做了茚三酮实验。首先，我们在茚三酮的水溶液中加入氨基化的 HMSN 纳米颗粒，加热煮沸后，溶液变成了蓝紫色（如图 3-6 左所示），说明纳米颗粒中有氨基存在。然后，为了证明氨基是接在纳米颗粒上，而不是游离的，我们将氨基化的 HMSN 离心后的上清液加入到茚三酮水溶液中，加热煮沸后，溶液颜色没有发生变化（如图 3-6 右所示），这说明上清液中没有氨基存在，进一步说明氨基是存在于 HMSN 纳米颗粒的表面的。
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总结
本论文用不同的方法制备了中空介孔二氧化硅纳米颗粒，在载药和治疗方面做了研究和应用。基于这个研究方向，具体开展了以下的工作：
第一章：综述了硅基纳米载体在生命科学中的研究应用。对介孔二氧化硅和中空介孔二氧化硅的制备和在药物载体方面的应用做了总结。
第二章：以十六烷基三甲基溴化铵作介孔模板剂，金纳米颗粒作硬模板，制备了一系列空腔大小相同、介孔二氧化硅壳层厚度不同和介孔二氧化硅壳层厚度相同、空腔大小不同的中空介孔二氧化硅。在制备过程中首先将介孔模板剂通过煅烧的方法除去，然后将金纳米颗粒通过腐蚀的方法除去，这样既能保证将介孔模板完全除去，又能维持中空结构的完整性。该方法制备的中空介孔二氧化硅大小均匀，空腔明显，结构可调，分散性良好，细胞毒性小，是良好的纳米药物载体。本章分别研究了中空介孔二氧化硅对抗癌药物阿霉素的装载量以及阿霉素的释放速度与载体结构之间的关系。另外，还研究了不同的除模板方式得到的中空介孔二氧化硅的载药能力的区别。实验结果表明，中空介孔二氧化硅的载药量和药物的释放速度均与药物载体的结构有关，并且药物释放是厚度控制的释放。
第三章：以二氧化硅实心球为硬模板，制备了中空介孔二氧化硅纳米颗粒。通过静电作用，在中空介孔二氧化硅的表面包覆两种单链 DNA 作为药物载体的阀门。这两种 DNA 分别与两种重要的肿瘤标志物 TK1 mRNA 和 GalNAc-T mRNA完全互补配对。由于 TK1 mRNA 和 GalNAc-T mRNA 在癌细胞中均过表达，会分别与上述两种 DNA 互补配对形成双链，进而使药物载体的阀门同时打开，引发药物释放。由于一些肿瘤标志物在某些正常细胞中也是过表达的，因此一种 DNA 阀门会引起药物不预期的释放，而两种 DNA 阀门可以在很大程度上避免这种结果。结合中空介孔二氧化硅载药量大，生物相容性好的特点，预计可以更有效地杀伤癌细胞，而对正常细胞没有伤害，这在癌症的治疗中是非常有意义的。
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本文编号：9867
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