MGMT基因沉默增强黑色素瘤细胞对替莫唑胺敏感性的研究

发布时间：2021-10-25 21:41

　　目的探讨O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（MGMT）基因沉默对人黑色素瘤细胞替莫唑胺（TMZ）敏感性的影响。方法将前期构建的靶向MGMT基因特异性短发夹型RNA（shRNA）干扰载体转染人黑色素瘤A375细胞。根据转染质粒的不同及是否加药分组如下:对照组、TMZ组、阴性对照（NC）组、NC-TMZ组、MGMT干扰（MGMTi）组和MGMTi-TMZ（MGMT干扰联合TMZ）组。通过实时荧光定量PCR（qPCR）、Western blotting和免疫荧光验证质粒载体的干扰效率,MTT法和流式细胞术检测TMZ处理24、48和72 h后A375细胞的增殖和凋亡情况。Western blotting和免疫荧光检测ATR、ATM和γ-H2AX水平以评价细胞DNA的损伤程度。结果转染MGMT shRNA干扰载体后,MGMTi组MGMT在mRNA和蛋白水平与对照组相比降低（P<005）。MTT、流式细胞仪、Western blotting和免疫荧光检测结果显示,MGMTi-TMZ组的细胞抑制率、凋亡率及ATR、ATM和γ-H2AX水平较其他组明显升高（P<005... 

【文章来源】：临床肿瘤学杂志. 2020,25(12)北大核心

【文章页数】：7 页

【部分图文】：

各组A375细胞的增殖抑制曲线

图4 各组A375细胞凋亡检测的流式细胞记录图综上所述，沉默MGMT基因的表达能够增强TMZ对A375细胞增殖的抑制作用并促进细胞凋亡，同时增强DNA损伤作用。通过沉默MGMT基因可以提高人黑色素瘤A375细胞对TMZ的敏感性。

图2 各组A375细胞的增殖抑制曲线MGMT主要通过“自杀式”作用将DNA上的烷基或甲基予以置换而修复DNA，置换后MGMT分子即失去活性，因此细胞内MGMT的活性直接与MGMT的表达水平呈正相关[18-19]。细胞内MGMT的高表达水平可以反映DNA修复水平及相应的化疗药物耐药能力。本研究首先使用前期构建成功的shRNA干扰载体转染A375细胞，在体外水平干扰MGMT基因的表达。Western blotting和qPCR结果表明MGMTi组的MGMT在转录和翻译水平上低于对照组。既往文献报道，在缺乏MGMT表达时，TMZ诱导的O6-甲基鸟嘌呤损伤不能被及时修复，累积在基因组中[13]。本研究结果提示细胞内MGMT基因沉默后，TMZ对黑色素瘤的杀伤作用显著增强，如MGMTi-TMZ组与NC-TMZ组相比抑制率升高，流式细胞术结果显示MGMTi-TMZ组的细胞凋亡率显著上升，提示沉默MGMT后可以增强TMZ对人黑色素瘤A375细胞的杀伤作用。DNA损伤是烷化剂杀伤细胞的重要形式，DNA损伤发生后，细胞内可出现一系列的损伤相关蛋白改变，包括ATM和ATR的磷酸化及γH2AX在核内表达增多等，这一系列变化可直接或间接反映细胞内DNA损伤水平[20]。进一步的研究发现，干扰MGMT基因表达后，TMZ导致的DNA损伤程度也显著增强，进一步证实了沉默黑色素瘤细胞中的MGMT基因可增强其对TMZ的敏感性。本研究构建的干扰载体证实抑制MGMT的表达可增强TMZ对黑色素瘤细胞的抗肿瘤效果，为后续体内实验提供重要理论依据和实验基础。

【参考文献】：
期刊论文
[1]靶向人MGMT的shRNA干扰载体的构建与鉴定[J]. 胡颖熹,冯城婷,陶敏,梁容瑞,赵晶,李玮,史悦,石凤灵,李大鹏.  现代仪器与医疗. 2018(06)



本文编号：3458217