DNA损伤修复基因多态性与白癜风罹患危险及光疗预后的关联及机制研究

发布时间：2017-05-16 17:10

  本文关键词：DNA损伤修复基因多态性与白癜风罹患危险及光疗预后的关联及机制研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：白癜风是一种常见的色素脱失性疾病，其主要病理特征为皮损部位黑素细胞的明显减少或消失。黑素细胞破坏或凋亡的机理迄今尚未完全阐明，关于白癜风发病机制的研究涉及自身免疫、代谢毒素、神经因子、遗传易感及氧化应激等众多方面。近年研究证实，氧化应激与黑素细胞受损之间存在着密切联系，白癜风患者皮损区H2O2存在过量蓄积。在体内氧化应激造成的DNA损伤的修复过程中，碱基切除修复(BER)通路起着主导作用。BER通路中关键酶的基因多态性与个体间DNA修复能力的强弱差异紧密相关，因此可能导致个体间清除UV、过氧化氢等氧化损伤的能力不同及罹患白癜风的危险差异。而在白癜风的治疗方面，窄谱中波紫外线(NB-UVB)是一种常用的有效手段，其治疗机理在于照射过程中形成环丁烷嘧啶二聚体(CPDs)等DNA光化产物，从而诱导皮肤的免疫抑制状态。而DNA光化产物的修复则主要由核苷酸切除修复(NER)通路来执行。NER通路关键酶的基因也存在着多态性，可导致个体间DNA光化产物修复能力的差异，介导不同的免疫抑制状态，从而影响白癜风患者的光疗预后。 目前尚无DNA损伤修复基因多态性与白癜风罹患危险和光疗预后的相关研究。因此，我们通过大样本病例对照研究，分析检测BER、NER通路关键基因的功能性单核甘酸多态性(SNP)位点在白癜风患者和健康对照人群的分布差异，结合功能学研究，揭示DNA损伤修复基因多态性与白癜风易感性和光疗预后的相关性，为白癜风发病机制研究和临床治疗提供新的线索和理论依据。 方法： 通过在线数据库和文献查找并确认BER、NER基因中MAF5%的功能性SNP位点及其在中国人群中的分布情况。首先，通过PCR-RFLP的方法分别检测4个BER SNP位点(hOGG1Ser326Cys、APE1Asp148Glu、ADPRT Val762Ala、XRCC1Arg399Gln)的基因型在1000例白癜风患者和1000例健康对照中的分布差异，4个NER SNP位点(XPA A23G、XPC Ci11A、XPC Lys939Gln、ERCC1C118T)的基因型在86例接受NB-UVB照射治疗的进展期白癜风患者中的分布频率，SAS软件分析不同基因型与白癜风罹患危险和光疗预后的关联性。选择其中具有显著关联性的SNP位点进行功能学验证。一方面，构建不同基因型的真核表达质粒，转染黑素细胞系PIG1，ELISA和核苷酸荧光电泳检测不同基因型黑素细胞抵抗氧化应激损伤的能力和蛋白酶活性的差异，ELISA检测不同基因型个体血清中8-OHdG水平差异，进一步验证BER SNP参与氧化应激条件下黑素细胞受损的具体机制。另一方面，流式细胞术、ELISA检测NB-UVB照射下不同基因型个体外周血T淋巴细胞凋亡差异和CPDs产生水平，验证NER SNP对白癜风光疗预后的影响。 结果： 1.通过统计学分析发现，与携带有APE1148Asp/Asp基因型的个体相比，携带Asp/Glu和Glu/Glu基因型的个体其罹患白癜风的危险显著增加(校正OR1.24,95%可信区间1.02-1.52;校正OR1.48,95%可信区间1.13-1.93)，而其它3个BER SNP位点与白癜风罹患危险无明显关系。进一步的APE1Asp148Glu基因型与临床表型关联分析发现白癜风易感性的增加主要表现在以下临床表型中：发病年龄大于20岁、女性、非节段型白癜风、病情活动、无白癜风家族史、不伴有其它自身免疫性疾病者。 2. ELISA检测结果显示，与携带有APE1148Asp/Asp基因型的患者相比，携带Asp/Glu和Glu/Glu基因型的患者其外周血血清8-OHdG水平显著升高(P 0.001)，该差异在吸烟患者中也明显存在(P 0.001)。进一步的分层分析发现，外周血血清8-OHdG水平与白癜风罹患危险存在一种剂量依赖关系(Ptrend0.05)。APE1Asp148Glu基因型与环境因素关联分析发现，拥有APE11481-2个危险等位基因(Asp/Glu或Glu/Glu)伴血清中较高8-OHdG水平(≥694.71pg/ml)的个体，其罹患白癜风的危险性显著高于拥有0个危险等位基因(Asp/Asp)伴较低8-OHdG水平(533.84pg/ml)的个体(校正OR,3.99,95%CI,1.29 12.38)。 3.成功构建APE1Asp148Glu不同等位基因的表达质粒pCDNA3.1-APE1-148Asp和pCDNA3.1-APE1-148Glu。在H2O2诱导的氧化应激条件下，ELISA检测结果显示，转染pCDNA3.1-APE1-148Asp组与转染pCDNA3.1-APE1-148Glu组相比其8-OHdG水平显著下降(P 0.05)。核苷酸荧光电泳结果显示，转染pCDNA3.1-APE1-148Asp和pCDNA3.1-APE1-148Glu表达质粒组的黑素细胞相比，其蛋白提取物核酸内切酶活性物无明显改变。 4.通过统计学分析发现，与携带ERCC1118TT和CT基因型的患者相比，携带CC基因型的患者其NB-UVB治疗效果更好：复色效果较佳，治疗时间缩短，累积照射剂量降低，首次复色时间提前(P=0.010; P=0.005; P=0.018; P=0.026)。而其它3个NER SNP位点与白癜风光疗预后未见明显相关。 5.流式细胞术结果显示，NB-UVB照射下，与携带ERCC1118TT和CT基因型的患者相比，携带CC基因型的患者T淋巴细胞早期和晚期凋亡比率均增加(P 0.01)。ELISA检测结果显示，NB-UVB照射下，与携带ERCC1118TT和CT基因型的患者相比，携带CC基因型的患者T淋巴细胞中CPDs水平显著升高。 结论： 1. APE1Asp148Glu该SNP位点与白癜风发病显著相关，Asp/Glu和Glu/Glu基因型的个体与Asp/Asp基因型的个体相比患病危险增高；hOGG1Ser326Cys、ADPRTVal762Ala、XRCC1Arg399Gln3个SNP位点对白癜风发病无明显影响。 2. APE1Asp148Glu该SNP变异可减弱BER修复能力，增加黑素细胞的氧化性DNA损伤，导致黑素细胞受损，从而增加白癜风的罹患危险。 3. ERCC1C118T该SNP位点与白癜风光疗预后有显著关联性，CC基因型的个体与TT和CT联合基因型的个体相比具有较好的预后效果；XPA A23G、XPC Ci11A、XPC Lys939Gln3个SNP位点对白癜风光疗预后无明显影响。 4. ERCC1C118T CC基因型可导致T淋巴细胞NB-UVB照射下DNA光化产物CPDs的增多，诱导细胞的凋亡，从而参与白癜风光疗的预后。
【关键词】：白癜风 APE1 ERCC1 单核苷酸多态性 8-OHdG CPDs 氧化应激 光疗
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R758.41
【目录】：

• 缩略语表5-8
• 中文摘要8-12
• 英文摘要12-16
• 前言16-17
• 文献回顾17-26
• 实验一 BER 基因单核苷酸多态性与白癜风罹患危险的关联性研究26-42
• 1 材料26-27
• 2 方法27-31
• 3 结果31-40
• 4 讨论40-42
• 实验二 APE1ASP148GLU单核苷酸多态性提高人黑素细胞氧化损伤程度的机制研究42-52
• 1 材料42-43
• 2 方法43-45
• 3 结果45-49
• 4 讨论49-52
• 实验三 NER 基因单核苷酸多态性与白癜风光疗预后的关联性研究52-63
• 1 材料52-53
• 2 方法53-56
• 3 结果56-60
• 4 讨论60-63
• 实验四 ERCC1 C118TCC 基因型提高白癜风光疗预后效果的机制研究63-72
• 1 材料63-64
• 2 方法64-66
• 3 结果66-69
• 4 讨论69-72
• 小结72-74
• 参考文献74-87
• 附录87-90
• 个人简历和研究成果90-91
• 致谢91

【共引文献】

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本文编号：371426