人皮肤成纤维细胞光源性提前衰老模型的建立与相关miRNA筛查分析及miR-34c调控光老化进程作用的研究

发布时间：2017-05-23 21:07

  本文关键词：人皮肤成纤维细胞光源性提前衰老模型的建立与相关miRNA筛查分析及miR-34c调控光老化进程作用的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景 光是一把双刃剑，一方面人们的生活离不开光，，另一方面光又因其生物学作用不可避免的对人体产生伤害。日光中紫外线可引起日晒红斑、日晒黑、光老化、光敏性皮肤病甚至发生癌症。 衰老是一种不可避免的自然规律，在皮肤上主要表现为皮肤粗糙、增厚、松弛，自然因素或非自然因素均可导致皮肤衰老的发生。皮肤衰老的研究一直是近年来的热点，尽管已鉴定出许多衰老相关蛋白，但衰老的信号通路及其调节机制尚不清楚。 MicroRNAs（miRNAs）是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，其大小长约20~25个核苷酸。miRNA芯片技术是一种快速有效检测miRNA表达谱的方法，经此方法筛选出的差异表达的miRNA，可通过质粒、腺病毒、慢病毒转染等方式上调/下调其表达，进一步进行功能学研究。 目的 本研究将采用多次低剂量UVB照射HDFs的方法，构建应激诱导的提前衰老（UVB-stress induced premature senescence, UVB-SIPS）模型，然后通过microRNA芯片技术筛选该模型中差异表达的miRNA并进行生物信息学分析，找出用UVB照射HDFs构建的UVB-SIPS模型中差异表达miRNA，并对其中感兴趣的miRNA-34c与老化相关基因p53、p21、p16及sirt1在UVB-SIPS中的作用进行初步研究。 方法 1.建立及验证UVB照射诱导的人皮肤成纤维细胞提前衰老模型 取健康青少年男子环切术切除的包皮，分离真皮HDFs后进行传代培养，取10-15代细胞进行实验，采用不同剂量的UVB照射细胞，观察细胞衰老-β-半乳糖苷酶染色（SA-β-Gal）、G1期阻滞率及细胞凋亡率，以筛选最佳UVB照射剂量；并用Real-time PCR及western blotting检测UVB-SIPS模型中衰老相关基因p53、p21、p16及sirt1的mRNA和蛋白表达。 2. microRNA芯片筛选差异表达的microRNA及生物信息学分析 首先进行microRNA芯片分析，以归一化强度的|log2（Ratio）|≥2和P 0.05为条件筛选上述UVB-SIPS模型中差异表达的miRNA，通过TargetScan数据库对部分差异表达的miRNA进行靶基因预测，并对所得靶基因进行基因功能的显著性分析（GO-Analysis），构建miRNA与基因调控网络，从而得出该网络中具有重要调控地位的核心miRNA和被调控的关键靶基因，并分析其基本功能。 3. miR-34c在UVB照射诱导的提前衰老模型中作用机制的研究 根据生物信息学分析结果与文献报道，选择UVB照射后表达上调的miR-34c为切入点，运用慢病毒感染技术沉默miR-34c的表达，再以前述所筛选出的最佳UVB剂量照射HDFs诱导提前衰老，观察衰老相关生物学指标SA-β-Gal、细胞周期阻滞率以及衰老相关基因p53、p21、p16及sirt1的mRNA及蛋白表达。 结果 1.总剂量50mJ/cm2的UVB平均分5日照射后3d，可诱导人皮肤成纤维细胞进入提前衰老状态 接受不同照光剂量（25mJ/cm2、50mJ/cm2、75mJ/cm2）的HDFs其SA-β-Gal阳性率及G1期阻滞率均明显高于空白对照组（P0.05），以总剂量25mJ/cm2、50mJ/cm2的UVB照射的HDFs其凋亡率与空白对照组无明显差异。当UVB照射总剂量达75mJ/cm2可明显引起细胞凋亡（P＜0.05）。依此选择构建诱导UVB-SIPS模型的最佳照射总剂量为50mJ/cm2，平均分5日照射，每日剂量为10mJ/cm2。 2. miRNA芯片筛选出UVB-SIPS模型中差异表达的miRNA 相对于空白对照组细胞，在UVB-SIPS组细胞中以|log2（比）|≥2和P0.05为标准选择有显著表达差异的miRNA，筛选出8个上调的miRNA，分别为hsa-miR-1224-3p、hsa-miR-197-3p、hsa-miR-1976、has-miR-23a-5p、hsa-miR-34c-5p、hsa-miR-4701-5p、hsa-miR-574-5p和hsa-miR-766-3p；5个下调的miRNA，分别为hsa-miR-1185-1-3p、hsa-miR-1185-2-3p、hsa-miR-4638-5p、hsa-miR-4695-5p和hsa-miR-933。对上述miRNA进行生物信息学分析，并通过TargetScan数据库预测这些miRNA的靶基因，构建miRNA与基因调控网络，从而得到该网络中具有重要调控地位的核心miRNA和被调控的关键靶基因。通过生物信息学分析发现上调miRNA预测靶基因功能主要集中于能量代谢、免疫反应、色素代谢等，下调miRNA预测靶基因功能主要集中于成纤维细胞增值功能负调控、跨膜信号传导等。 3. miR-34c对UVB照射诱导的人皮肤成纤维细胞提前衰老有促进作用。 运用慢病毒感染HDFs沉默miR-34c表达后再次予前述构建UVB-SIPS模型相同UVB剂量照射，SA-β-Gal阳性率及G1期阻滞率均较单纯UVB照射组降低（P0.05），老化相关基因p53、p21、p16及sirt1的mRNA及蛋白表达均较单纯UVB照射组降低（P0.05）。 结论 综上所述，miR-34c通过影响老化相关基因p53、p21、p16及sirt1mRNA及蛋白的表达，对UVB照射诱导的HDFs提前衰老具有促进作用。
【关键词】：成纤维细胞 UVB miRNA芯片 miR-34c 衰老相关基因
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R751
【目录】：

• 全文技术流程图5-6
• 全文主要缩略语6-8
• 中文摘要8-11
• Abstract11-14
• 第一部分 UVB 诱导的人皮肤成纤维细胞提前衰老（UVB-SIPS）模型的建立及验证14-39
• 前言14-16
• 材料与方法16-31
• 结果31-39
• 第二部分 人皮肤成纤维细胞 UVB-SIPS 模型中差异表达 microRNA 的筛选、验证及其生物信息学分析39-54
• 前言39-40
• 材料与方法40-44
• 结果44-54
• 第三部分 沉默miR-34c对人皮肤成纤维细胞UVB-SIPS模型衰老进程的抑制作用54-67
• 前言54-55
• 材料与方法55-59
• 结果59-67
• 讨论67-74
• 全文小结74-75
• 文献综述75-81
• 参考文献81-85
• 攻读学位期间发表文章情况85-86
• 附录86-89
• 致谢89

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  本文关键词：人皮肤成纤维细胞光源性提前衰老模型的建立与相关miRNA筛查分析及miR-34c调控光老化进程作用的研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：389110