吲哚胺2，3-双加氧酶2对小鼠黑色素瘤生长的影响及其在肿瘤治疗中的应用研究

发布时间：2017-08-08 15:16

  本文关键词：吲哚胺2，3-双加氧酶2对小鼠黑色素瘤生长的影响及其在肿瘤治疗中的应用研究

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【摘要】：第一部分:IDO2表达对黑色素瘤细胞B16-BL6生物学行为的影响目的:研究吲哚胺2,3-双加氧酶2(IDO2)表达对小鼠黑色素瘤细胞生物学行为的影响。方法:采用IDO2-si RNA沉默小鼠黑色素肿瘤细胞株B16-BL6内IDO2的表达后,q PCR检测IDO2 m RNA的表达水平,Western blot法检测IDO2蛋白的表达水平,MTT法检测B16-BL6细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期,Ehrlich’s法检测细胞内犬尿氨酸生成水平,NAD+/NADH试剂盒检测细胞内NAD+水平,H2DCFDA染色检测细胞内活性氧水平。结果:实时荧光定量PCR法及Western-blot法结果显示,沉默小鼠黑色素瘤细胞系B16-BL6中IDO2基因后,其m RNA以及蛋白的表达水平均显著下降,沉默效率达80%以上;MTT结果显示,沉默IDO2基因后的B16-BL6细胞增殖能力受到明显抑制;流式细胞术检测结果发现,IDO2基因沉默后B16-BL6细胞的G0/G1期细胞比例明显增加,而S期和G2/M期细胞比例则明显降低,其凋亡发生率明显增加;Ehrlich’s法结果显示IDO2基因沉默减少了细胞内犬尿氨酸生成;IDO2基因沉默后NAD+生成减少,同时细胞内活性氧ROS的含量增加;补充外源性NAD+后IDO2基因沉默引起的细胞凋亡减轻。结论:IDO2在B16-BL6细胞内具有酶学活性,沉默B16-BL6细胞内IDO2基因的表达可改变肿瘤细胞的生物学特性,包括:抑制肿瘤细胞增殖、诱导凋亡、使细胞周期积聚在G1期。B16-BL6细胞凋亡与IDO2沉默后NAD+的生成减少有关。第二部分:B16-BL6细胞内IDO2基因表达对黑色素瘤形成生长的影响目的:体内研究B16-BL6细胞内IDO2基因表达对小鼠黑色素瘤生长过程的影响。方法:构建IDO2-sh RNA质粒并进行鉴定;通过G418药物筛选建立稳定细胞系B16-BL6/IDO2+及B16-BL6/IDO2-,流式细胞术检测所构建细胞的绿色荧光百分比,实时荧光定量PCR检测IDO2 m RNA的表达水平;以B16-BL6/IDO2+及B16-BL6/IDO2-细胞在小鼠体内建立肿瘤模型,游标卡尺测量肿瘤大小,观察IDO2表达对黑色素瘤形成、生长的影响;流式细胞仪检测引流淋巴结内Treg和CD8+/CD8+T细胞数量、T淋巴细胞凋亡率,观察肿瘤组织内IDO2表达对引流淋巴结内免疫系统的影响。结果:成功构建IDO2-sh RNA质粒;成功建立B16-BL6/IDO2+及B16-BL6/IDO2-稳定细胞系:两种稳定细胞携带绿色荧光百分比达98%以上,B16-BL6/IDO2-细胞持续稳定低表达IDO2,并且经典的刺激因子IFN-g不能诱导其表达上调;与B16-BL6/IDO2+细胞相比,接种B16-BL6/IDO2-细胞至小鼠体内,其肿瘤形成时间延长、生长速度减慢、肿瘤重量减轻;引流淋巴结内Treg百分比下降、CD8+T细胞数量增加、T淋巴细胞的凋亡减少。结论:黑色素瘤细胞内IDO2的表达对肿瘤的生长起着促进作用,且能影响其引流淋巴结内肿瘤免疫反应。第三部分:以IDO2为治疗靶标进行抗肿瘤治疗的研究目的:以IDO2作为治疗靶标,研究IDO2基因表达在肿瘤治疗中的作用及其对免疫应答的影响。方法:1.IDO2-sh RNA及scramble-sh RNA尾静脉高压注射法进行抗肿瘤治疗,游标卡尺测量肿瘤大小;流式细胞术检测各组小鼠脾脏及引流淋巴结内Treg细胞百分比、T细胞凋亡百分比,以及脾脏内树突状细胞表面共刺激分子表达情况;LDH法检测CD8+T淋巴细胞杀伤肿瘤细胞的能力;3H掺入法检测淋巴细胞抗原回忆反应;ELISA法检测血清内TNF-a、IFN-g表达水平。2.体外沉默树突状细胞内的IDO2基因后,流式细胞术检测树突状细胞表面共刺激分子表达水平;IDO2基因沉默的树突状细胞与T细胞共培养,CFSE标记法检测异基因混合淋巴细胞反应,流式细胞术检测Treg细胞百分比。结果:1.IDO2-sh RNA治疗组肿瘤的形成时间较晚,肿瘤的生长速度缓慢,离体肿瘤重量明显减轻;IDO2-sh RNA治疗组脾脏及引流淋巴结内的Treg细胞百分比减少,T细胞凋亡百分比下降,脾脏树突状细胞表面共刺激分子CD80、CD86明显增加;IDO2-sh RNA治疗组小鼠体内T细胞抗原回忆能力增加,CD8+T细胞杀伤B16-BL6的能力增强,血清内TNF-a、IFN-g表达水平升高。2.体外沉默树突状细胞内IDO2基因后,表面共刺激分子CD80、CD86的表达百分比增加,树突状细胞刺激异基因T淋巴细胞增殖的能力增强,诱导Treg细胞的百分比下降。结论:沉默荷瘤小鼠体内IDO2可以有效抑制黑色素瘤生长,提高机体的抗肿瘤免疫反应。
【关键词】：吲哚胺2 3-双加氧酶2 NAD+ ROS 细胞凋亡 细胞周期 黑色素瘤 IDO2 sh RNA 稳定转染 引流淋巴结 IDO2 sh RNA 黑色素瘤 静脉高压注射法 肿瘤免疫
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R739.5
【目录】：

• 摘要3-6
• ABSTRACT6-12
• 中英文缩写一览表12-15
• 引言15-20
• 第一部分 IDO2表达对黑色素瘤细胞B16-BL6生物学行为的影响20-53
• 1 实验材料与方法20-41
• 1.1 实验材料20-24
• 1.2 实验方法24-40
• 1.3 统计学分析40-41
• 2 结果41-48
• 2.1 最佳引物序列41
• 2.2 IDO2在各小鼠肿瘤细胞内的表达情况41-42
• 2.3 最佳siRNA序列筛选42
• 2.4 IDO2-siRNA沉默B16-BL6细胞内IDO2基因42-44
• 2.5 IDO2基因沉默后酶功能检测44-45
• 2.6 IDO2基因表达对B16-BL6细胞生物学行为的影响45-48
• 2.7 NAD+抗凋亡实验48
• 3 讨论48-53
• 第二部分 IDO2基因表达对黑色素瘤形成生长的影响53-73
• 1 实验材料与方法53-64
• 1.1 实验材料53-54
• 1.2 实验方法54-64
• 1.3 统计学分析64
• 2 结果64-69
• 2.1 重组质粒IDO2-shRNA的鉴定64
• 2.2 B16-BL6/IDO2 +及B16-BL6/IDO2-稳定细胞株的建立64-65
• 2.3 稳定细胞株内IDO2 mRNA的表达65
• 2.4 稳定细胞株对IFN-g诱导反应的检测65-66
• 2.5 B16-BL6细胞内IDO2表达对体内肿瘤生长的影响66-67
• 2.6 B16-BL6细胞内IDO2表达对肿瘤引流淋巴结免疫环境的影响67-69
• 3 讨论69-73
• 第三部分：以IDO2为治疗靶标进行抗肿瘤治疗的研究73-103
• 1 实验材料与方法73-86
• 1.1 实验材料73-74
• 1.2 实验方法74-86
• 1.3 统计学分析86
• 2 结果86-97
• 2.1 IDO2-shRNA治疗黑色素瘤的抑瘤效果86-87
• 2.2 IDO2-shRNA治疗对机体肿瘤免疫反应的影响87-93
• 2.3 IDO2表达对小鼠树突状细胞生物学特性及功能的影响93-97
• 3 讨论97-103
• 结论103-104
• 致谢104-105
• 参考文献105-114
• 攻读学位期间的研究成果114-115
• 综述115-123
• 参考文献121-123

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