表皮干细胞分裂参与银屑病斑块皮损持续增殖的分子机制研究

发布时间：2017-08-28 15:26

  本文关键词：表皮干细胞分裂参与银屑病斑块皮损持续增殖的分子机制研究

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【摘要】：研究背景及目的 银屑病(psoriasis)是一种常见的多基因遗传,多种因素参与的慢性炎症性皮肤病。发病率约为2%,可累及所有种族。临床上存在难治愈,易复发的特点,严重影响患者身心健康。表皮角质形成细胞过度增殖以及异常分化是其主要病理特征。很长时间以来,人们在探究银屑病的发病机制时,着眼点都放在角质形成细胞上,认为银屑病是一种角质形成细胞疾病。然而,这种观点并不能解释银屑病病理中淋巴细胞(绝大多数为T细胞)浸润,真皮血管改变等特征。随着免疫因素在银屑病发病中的作用越来越清晰,进而提出银屑病是一种T细胞免疫介导性皮肤病。其中CD4+T淋巴细胞免疫功能异常在其发病中尤为重要。 近年来,发现的一类CD4+T细胞亚群Thl7细胞,以高表达IL-17为特征,在银屑病发病中的作用已成为研究的热点。初始T细胞在TGF-p和IL-6的共同作用下通过特异性转录因子RORγt分化发育成为Th17细胞。活化的树突状细胞分泌大量IL-23,它与Th17细胞表面的IL-23R结合,通过转录因子STAT3诱导IL-17A、IL-17F、IL-22等细胞因子的转录。这些细胞因子与角质形成细胞上的相应受体IL-17R, IL-22R结合发挥炎症和促进角质形成细胞增殖分化的作用。由此可见,银屑病更是一种角质形成细胞和免疫细胞之间相互作用失衡的疾病。然而,对表皮干细胞在银屑病表皮增殖中的作用及其在持续增殖状态下如何免遭基因组复制错误或突变以维持干细胞群数目恒定的机制仍知之甚少。 表皮细胞可分为三种亚群,即表皮干细胞(epithelial stem cells; ESCs),短暂扩充细胞(transit amplifying cells; TACs)和有丝分裂后分化细胞(postmitotic cells; PMCs)。ESCs在皮肤稳态中发挥重要作用。大多数情况下,表皮干细胞处于静止状态,当受到创伤或理化等因素刺激时,可激活并增殖分化参与皮肤稳态的修复使表皮始终处于增殖、分化和脱屑状态,并且增殖与脱屑的速度保持大致平衡。细胞从基底层到达皮肤表面的时间,包括表皮细胞由基底层增殖、分化过渡到棘细胞层以及进一步分化为无完整细胞器结构的角质层所需要的时间,称之为表皮通过时间。正常皮肤的表皮通过时间为52～75天,但在银屑病这一时间大大缩短,仅8-10天。ESCs通过对称和不对称分裂进行增殖。前者多发生于胚胎发育过程以增加皮肤表面积或成体皮肤稳态遭遇伤害后的增殖修复过程中,而后者在使干细胞产生子代干细胞维持自身特性(自我更新)的同时也能产生分化的子代细胞-短暂扩充细胞。短暂扩充细胞经过几次短暂细胞分裂后退出细胞周期进入终末分化程序,且一旦开始便不能逆转。因此不对称分裂是其维持恰当的干细胞数量的一种方式,因而被认为是干细胞的典型特征。表皮中的不对称细胞分裂类型有两种：一种是纺锤体平行于基底膜,另一种是细胞分裂平面垂直于基底膜。发生在成体皮肤中的分裂层面和基底膜平行的不对称分裂模式,两个子细胞暂时都在基底层,其中一个子细胞可能接受了不等量的调控整合素分子表达下调随后使其脱离基底层的信号。一旦对称和不对称分裂的精密调控被破坏,不仅会导致干细胞数量的改变,还会促使TA细胞群极度扩增导致皮肤表皮持续增殖。DNA“不死”链(DNAimmortal strands)假说认为,成体干细胞(adult stem cells)在分裂过程中,含有相对比较古老的DNA链(又被称作“不死”链)的染色体总是被分配给将要成为干细胞的子代细胞,含有相对新合成DNA链的染色体被分配给趋向分化并最终衰老死亡的另一个子代细胞。这样通过“不死”DNA链在子代细胞和干细胞中的不对称分配,使“不死”DNA链永远保留在干细胞中保护其基因组避免可能发生的复制错误和突变。因此我们推测银屑病斑块持续增殖的原动力可能为1)银屑病表皮基底层干细胞很可能被激活,以水平和垂直不对称分裂方式迅速增殖产生大量TA细胞,导致银屑病表皮TA细胞群极度扩增(图1-7)；2)银屑病基底层干细胞在不对称分裂过程中,总是把含有相对比较古老的DNA链(“不死”链)的染色体分配给将要成为干细胞的子代细胞,把含有相对新合成DNA链的染色体分配给趋向分化并最终衰老死亡的另一个子代细胞(图2-2),以保护其基因组避免在持续增殖状态下可能发生的复制错误来保证干细胞群不被耗竭； 表皮终末分化是一个精细调节的过程,细胞由基底层向基底浅层迁移是分化过程关键性的第一步,在分化过程的每个阶段高度表达特异性角蛋白。在表皮基底层分裂活跃的角质形成细胞主要表达干细胞标记物角蛋白15(Keratin; K15);当角质形成细胞移行至棘层时失去分裂能力,便关闭K15的表达,开启分化特异性角蛋白K10的表达。 因此,在本研究中,我们用免疫组织化学染色技术检测了银屑病斑块皮损和正常人皮肤中干细胞以及增殖、分化相关标记物,观察银屑病斑块皮损TA细胞群变化；用溴脱氧尿嘧啶(bromodeoxyuridine; BrdU)标记IMQ诱导的银屑病样皮炎小鼠,检测基底层干细胞有丝分裂；用BrdU脉冲示踪技术研究人角质形成细胞DNA模板链分离,观察比较银屑病和正常人表皮细胞发生不对称分裂的比例；用IL-17A和IL-22处理人角质形成细胞和从皮肤移植物边缘长出的第一代表皮细胞片(epidermal cell sheet),观察其对分化相关蛋白表达的影响,以期揭示表皮干细胞活化及其参与银屑病表皮持续性增厚的方式和可能涉及的分子机制。 研究方法与结果 1.斑块型银屑病皮损中TA细胞群扩增：用免疫组化技术检测银屑病皮损和正常皮肤标本干细胞标记蛋白(K15和ITGB1),TA细胞标记蛋白(ITGB1),有丝分裂后细胞(PMCs)标记蛋白(K10)和细胞增殖标记抗原(Ki67)。结果显示与正常皮肤相比,银屑病表皮ITGB1和K15的表达明显降低,基底浅层细胞Ki67阳性染色比例显著增加,K10阳性角质形成细胞却延迟出现,直到棘层浅层才有阳性染色。 2.IMQ诱导小鼠银屑病样皮炎基底层细胞有丝分裂相观察：用咪喹莫特乳膏外搽小鼠背部皮肤,每天一次,连续6天后,小鼠背部皮肤增厚,有红斑、鳞屑,发生类似银屑病样改变。用BrdU标记IMQ诱导的皮炎小鼠,免疫组织化学技术检测其基底细胞有丝分裂的细胞数,结果表明小鼠皮炎模型中检测到BrdU标记的基底细胞有丝分裂比例为6%,而对照组为几乎检测不到。在IMQ处理组,BrdU标记基底层细胞存在两种不对称细胞分裂方式,水平和垂直细胞分裂。 3.银屑病与正常人角质形成细胞发生不对称分裂比例比较：用BrdU脉冲示踪标记方法,检测原代培养的银屑病和正常人角质形成细胞有丝分裂时DNA模板链分离方式。结果表明,银屑病表皮角质形成细胞对BrdU标记发生不对称分离比例(约为10%)比正常表皮细胞(仅3%)高。银屑病与正常人角质形成细胞模板链分离和K15表达的关系比较：用BrdU脉冲示踪标记原代培养的银屑病和正常人角质形成细胞,免疫双标方法检测BrdU标记的模板链分离和K15表达。结果表明,进行不对称分裂的原代角质形成细胞通常把模板链(未标记链)分配到表达K15的子细胞中。银屑病角质形成细胞同时表达K15且不对称标记BrdU(假定为第二轮细胞分裂中的不对称干细胞分裂)的比例(～13%)比正常增加(P＜0.05)。银屑病角质形成细胞同时表达K15且对称性标记BrdU(假定为第二轮细胞分裂中的干细胞自我更新)的比例(～32%)也比正常增加(P＜0.05)。 4.IL-17A和IL-22对从皮肤移植物边缘长出的第一代表皮细胞片(epidermal cell sheets)和原代培养的人角质形成细胞,表达增殖、分化相关抗原的影响：用从皮肤移植物边缘长出第一代上皮细胞组成的上皮细胞片,来构建一个表皮干细胞短期培养体系,然后,我们用10ng/ml的IL-17A和IL-22体外处理上皮舌24h。用免疫荧光方法检测上皮舌的K15和β1整合素表型。结果表明,不用细胞因子处理的上皮舌,表达K15和/或p1整合素的细胞局限在表皮舌外缘。然而,用IL-17A和IL-22处理后,整个上皮舌全层都表达K15和/或β1整合素,并且靠近移植物的内层细胞强表达p1整合素。同样,免疫印迹分析表明,高钙(1.3mM)和低钙(0.06mM)状态下培养的细胞用这两种细胞因子处理后,K15和β1整合素的表达与对照组相比均上调,并且这两种细胞因子也存在轻微协同作用。 研究结论 银屑病皮损基底层干细胞被激活并以不对称细胞分裂方式产生干细胞和TA细胞,使其既可通过自我更新维持干细胞库稳定又能产生分化细胞来补充极度扩增的TA细胞群。IL-17A和IL-22能上调表皮干细胞K15和p1整合素的表达,对维持干细胞表型有协同作用。这些结果阐明了过度增殖银屑病表皮避免干细胞群被耗竭的一种机制。因此,抑制过度活化的干细胞可为银屑病临床治疗提供一个潜在的靶点。
【关键词】：角质形成细胞 有丝分裂 白细胞介素 干细胞 银屑病
【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R758.63
【目录】：

• 论文创新点6-9
• 中文摘要9-13
• Abstract13-17
• 英文缩略词表17-18
• 引言18-20
• 第一部分 斑块型银屑病皮损干细胞标记蛋白以及增殖、分化相关蛋白表达的免疫组化分析20-30
• 第二部分 体内脉冲示踪技术联合免疫组化检测IMQ诱导小鼠银屑病样皮炎模型基底层细胞有丝分裂30-42
• 第三部分 斑块型银屑病皮损中不对称分裂干细胞比例测定42-52
• 第四部分 IL-17A和IL-22上调培养人表皮角质形成细胞干细胞52-68
• 全文结论68-69
• 参考文献69-73
• 文献综述73-84
• 参考文献80-84
• 攻读博士学位期间发表论文情况84-85
• 在读期间受到的奖励85-86
• 致谢86

【共引文献】

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本文编号：748365