MicroRNA-210在寻常型银屑病皮损中的表达及其对角质形成细胞的影响

发布时间：2017-09-01 14:17

  本文关键词：MicroRNA-210在寻常型银屑病皮损中的表达及其对角质形成细胞的影响

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【摘要】：目的 研究寻常型银屑病皮损中miR-210表达变化；预测及验证miR-210的靶基因；研究寻常型银屑病皮损中靶基因RUNX3蛋白表达变化；研究抑制miR-210表达对HacaT细胞RUNX3蛋白的表达、细胞增殖、凋亡、细胞周期的影响。 方法 取20例寻常型银屑病患者皮损和16例正常对照者皮肤组织,用TRIzol试剂提取总RNA,用蛋白质抽屉试剂盒提取总蛋白,应用Real-time PCR法对20例寻常型银屑病患者和16例正常对照检测miR-210的表达水平,应用western blot(?)检测蛋白表达水平。运用Mirbase/Targetscans/PicTar等靶基因预测软件查找miR-210可能的靶基因,筛选出与寻常型银屑病发病过程密切相关的基因作为候选靶基因,我们选定RUNX3为靶基因。构建RUNX3野生型(RUNX3WT-luciferase)和突变型(RUNX3Mut-luciferase)荧光素酶报告基因,与miR-210模拟物(miR-210mimic)和阴性对照(mimic control)用脂质体共转染至HacaT细胞,转染48小时后收集细胞,运用双荧光素酶报告基因检测系统,以海肾荧光素酶作为内参照,检测萤火虫荧光素酶的活性,在HacaT细胞中验证miR-210是否调控RUNX3表达。使用miR-210抑制物(miR-210inhibitor)和阴性对照(miR-210inhibitor control),脂质体法转染HacaT细胞,采用Real-time PCR法检测转染后miR-210的表达,采用Western blot法检测RUNX3蛋白表达水平,MTT法检测细胞活力,流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期。 结果 1.Real-time PCR结果显示：miR-210在寻常型银屑病患者组皮损中表达较正常对照组显著降低(p0.05)。western blot检测结果显示：相对于正常对照组,寻常型银屑病组皮损中RUNX3的蛋白表达水平显著升高(P0.05)。寻常型银屑病皮损中miR-210表达水平与RUNX3蛋白表达水平呈显著负相关(r=-0.849,p=0.002)。 2.在HacaT细胞中共转染]miR-210mimic或miR-210mimic control与RUNX3基因3'-UTR野生型报告载体(RUNX3WT-luciferase)或突变型报告载体(RUNX3Mut-luciferase),荧光素酶报告基因检测显示：与共转染miR-210mimic control和RUNX3WT-luciferase组相比,共转染miR-210mimic和RUNX3WT-luciferase组荧光素酶活性被显著抑制(p0.05),而当RUNX3-3'-UTR突变修饰后(RUNX3Mut-luciferase),荧光素酶活性无显著改变(P0.05)。 3.转染miR-210inhibitor的HacaT细胞相对于转染miR-210inibitor control组miR-210表达水平降低,RUNX3蛋白表达水平升高,差异均有显著统计学意义(P0.05),细胞增殖活力明显增加,凋亡水平下降,差异有统计学意义(P0.05),细胞周期各期无明显统计学意义(P0.05)。 结论 1.寻常型银屑病患者皮损中miR-210表达降低。 2.RUNX3为miR-210的靶基因,miR-210通过作用于RUNX33'-UTR区抑制报告基因表达,miR-210通过与靶基因RUNX3结合影响RUNX3蛋白表达水平。 3.HacaT细胞中miR-210表达水平降低导致细胞活力增加,凋亡减少,细胞周期无改变。
【关键词】：寻常型银屑病 皮损 miR-210 RUNX3 细胞活力 凋亡
【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R758.63
【目录】：

• 摘要5-8
• ABSTRACT8-11
• 目录11-12
• 缩略词表12-13
• 第一章 前言13-15
• 第二章 材料与方法15-38
• 1. 研究对象15-16
• 1.1 入选标准15
• 1.2 PASI评分15-16
• 2. 主要仪器设备及试剂16-19
• 2.1 主要实验仪器16-17
• 2.2 主要试剂及耗材17-18
• 2.3 其他常用试剂18
• 2.4 质粒准备18-19
• 3. 实验方法19-37
• 3.1 寻常型银屑病皮损和健康对照皮肤组织中miR-210表达水平的研究19-22
• 3.2 miR-210靶基因的预测和验证22-28
• 3.3 miR-210对靶基因及HacaT细胞的影响28-37
• 4. 统计学方法37-38
• 第三章 结果38-52
• 第四章 讨论52-55
• 第五章 结论55-56
• 参考文献56-60
• 综述60-68
• 参考文献65-68
• 在读期间发表论文情况68-69
• 致谢69

【共引文献】

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本文编号：772568