寻常型银屑病角质形成细胞及HaCaT细胞株糖酵解的初步研究

发布时间：2017-09-03 20:27

  本文关键词：寻常型银屑病角质形成细胞及HaCaT细胞株糖酵解的初步研究

  更多相关文章： 银屑病 糖酵解 缺氧 HIF-1α HaCaT

【摘要】：目的：寻常型银屑病是一种慢性炎症性皮肤病,具有表皮增殖过度、角化不全、真皮浅层毛细血管扩张及淋巴细胞浸润等特征,其表皮与恶性肿瘤存在细胞过度增殖和局域性缺氧等共同特点。缺氧诱导因子-1α (Hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)在肿瘤中能激活大部分糖酵解相关酶从而促使细胞代谢主要朝糖酵解方向进行。我们的前期研究发现CD147分子在银屑病患者皮损区及外周血细胞中高表达,并且是银屑病的易感基因之一,我们还发现CD147在恶性黑素瘤糖酵解过程中发挥重要作用,同时也能在HIF-1α的调节下介导肿瘤的侵袭转移。本文旨在探讨在寻常型银屑病和人类永生化角质形成细胞HaCaT细胞株中,HIF-1α、CD147及糖酵解相关蛋白可能发挥的作用及相互关系,为进一步揭示银屑病的发病机制提供新的理论依据。 方法：1、免疫组化法分析HIF-1α、CD147、葡萄糖转运体1(Glucose Transporter1, GLUT1)、糖酵解关键酶己糖激酶(Hexokinase2, HK2)、丙酮酸激酶(Pyruvate kinase2, PKM2)在寻常型银屑病皮损区及正常人表皮中的表达及分布,并行相关性分析； 2、构建小分子干扰片段RNA (Small interfering RNA, siRNA)并在HaCaT细胞中干扰HIF-1α蛋白表达,Western Blot检测HIF-1α、 CD147、GLUT1、HK2、PKM2蛋白表达的变化； 3、CoCl2诱导HaCaT细胞化学缺氧,Western Blot检测HIF-1α、 CD147、 GLUT1、HK2、PKM2蛋白表达的变化； 4、免疫荧光共聚焦法检测CD147和GLUT1蛋白在银屑病皮损表皮中表达的共定位； 5、siRNA干扰/过表达HaCaT细胞中CD147蛋白,Western Blot检测CD147、GLUT1蛋白表达的变化； 6、siRNA干扰/过表达HaCaT细胞中GLUT1蛋白, Western Blot检测GLUT1、CD147蛋白表达的变化。 结果：1、 HIF-lα、CD147、GLUT1、HK2、PKM2蛋白均在寻常型银屑病皮损区较正常人表皮表达增高,差异具有统计学意义(P0.05); 2、寻常型银屑病皮损中HIF-1α CD147与GLUT1蛋白的表达两两存在正相关性(P0.05), HK2、PKM2与其它指标均无相关性(P0.05)； 3、HaCaT细胞中干扰HIF-1α表达后,HIF-1α、CD147、GLUT1及HK2蛋白表达均显著下降(P0.05), PKM2表达无明显差异(P0.05); 4, CoCl2诱导HaCaT细胞化学缺氧后,HIF-1α、CD147、GLUT1及HK2蛋白表达均显著上升(P0.05),PKM2的表达无明显差异(P0.05)； 5、CD147和GLUT1蛋白在寻常型银屑病皮损区表达具有共定位现象,均分布在基底层细胞及棘层部分细胞的细胞膜上； 6、在HaCaT细胞中分别干扰和过表达CD147蛋白后,GLUT1蛋白的表达无明显差异(P0.05)； 7、在HaCaT细胞中分别干扰和过表达GLUT1蛋白后,CD147蛋白的表达无明显差异(P0.05)。 结论：1、寻常型银屑病患者角质形成细胞中糖酵解能力可能较正常人升高;2、缺氧诱导了HaCaT细胞中HIF-lα水平升高,进一步上调CD147、GLUT1和HK2蛋白的表达,可能增强了HaCaT细胞的糖酵解能力。
【关键词】：银屑病 糖酵解 缺氧 HIF-1α HaCaT
【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R758.63
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-10
• 目录10-12
• 主要~.略词表12-13
• 前言13-16
• 1 材料与方法16-27
• 1.1 材料16-20
• 1.1.1 主要试剂16-17
• 1.1.2 主要耗材17-18
• 1.1.3 主要仪器18-19
• 1.1.4 主要试剂的配制19-20
• 1.2 实验方法20-26
• 1.2.1 组织标本收集20
• 1.2.2 细胞株20
• 1.2.3 细胞培养20-21
• 1.2.4 siRNA转染HaCaT细胞21-22
• 1.2.5 质粒提取22
• 1.2.6 空载及CD147质粒转染HaCaT细胞22-23
• 1.2.7 CoCl_2诱导HaCaT缺氧23
• 1.2.8 目的蛋白质提取23
• 1.2.9 免疫印迹(Western Blot)检测目的蛋白表达水平23-24
• 1.2.10 免疫组化24-25
• 1.2.11 组织免疫荧光25-26
• 1.3 免疫组化评分标准26
• 1.4 统计学分析方法26-27
• 2 结果27-36
• 2.1 HIF-1α、CD147及糖酵解相关重要蛋白在寻常型银屑病患者皮损区和正常人皮肤表皮中的差异性表达27-32
• 2.2 在HaCaT细胞中干扰HIF-1α表达对CD147、GLUT1、HK2及PKM2蛋白表达的影响32-33
• 2.3 在HaCaT细胞中上调HIF-1α表达对CD147、GLUT1、HK2及PKM2蛋白表达的影响33-34
• 2.4 寻常型银屑病皮损中CD147和GLUT1蛋白的共定位34-35
• 2.5 HaCaT细胞中干扰和过表达CD147蛋白对GLUT1表达的影响35
• 2.6 HaCaT细胞中干扰和过表达GLUT1蛋白对CD147表达的影响35-36
• 3 讨论36-39
• 3.1 角质形成细胞中复杂的糖酵解机制36
• 3.2 HIF-1α对CD147和GLUT1的调控36-37
• 3.3 糖酵解在银屑病中的意义37-38
• 3.4 总结38-39
• 结论39-40
• 参考文献40-44
• 综述44-53
• 参考文献49-53
• 攻读学位期间参与课题及所获奖励53-54
• 致谢54

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