沙眼衣原体感染血清学免疫优势蛋白的筛选与优化

发布时间：2017-09-06 22:37

  本文关键词：沙眼衣原体感染血清学免疫优势蛋白的筛选与优化

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【摘要】：沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis, C.t)引起的泌尿生殖道感染目前己成为国内外最常见的性传播疾病之一。沙眼衣原体感染引起的并发症较多且较严重,该感染还显著增加HIV感染的危险性,并且可能与宫颈癌的形成有关[1]。其感染的另一个重要特点是症状隐匿,感染者往往成为重要储主和传染源,为控制沙眼衣原体感染,早期发现沙眼衣原体感染者并给与治疗,防止进一步传播是重要举措之一。目前我国临床上广泛使用的沙眼衣原体检测试剂盒针对的抗原多数是脂多糖(Lipopolysaccharides, Lps),主要外膜蛋白(Major Outer Oembrane Protein, MOMP)或热休克蛋白60(Heat Shock Protein 60,HSP60)。然而Lps缺乏特异性,和其他病原体的Lps抗原具有一定的交叉反应。近年来越来越多的研究显示MOMP和HSP60虽有较好的抗原性和特异性,但不属抗原性最强的前20种蛋白之列,因此用于检测的敏感性不够,可能导致误诊。为了寻找更适合沙眼衣原体感染筛查的方法,本实验选取近年来国外陆续报道的了8种沙眼衣原体免疫优势蛋白进行蛋白的表达、验证,以MOMP和HSP60为对照,收集临床沙眼衣原体感染者和未感染者的血清,ELISA方法检测血清中抗所表达衣原体抗原的抗体,寻找适用于我国早期筛查沙眼衣原体感染的抗原蛋白组合。目的：表达衣原体质粒编码蛋白3(Pgp3)、衣原体蛋白酶样活性因子(CPAF)、C.t143编码蛋白(CT143)、C.t101编码蛋白(CT101)、C.t694编码蛋白(CT694)、C.t875编码蛋白(CT875)、C.t813编码蛋白(CT813)、C.t119编码蛋白(IncA)8种沙眼衣原体免疫优势蛋白,以MOMP和HSP60为对照,检测泌尿生殖道沙眼衣原体感染者血清中10种沙眼衣原体蛋白的IgG抗体,比较上述几种蛋白的抗原性,确定具有最高敏感性和特异性的抗原蛋白组合。优化适用于沙眼衣原体感染血清学筛查的免疫优势蛋白的组合。方法：将编码上述10种蛋白的基因重组质粒转化入大肠杆菌感受态BL-21,IPTG诱导目的蛋白的表达,GST Magbeads进行蛋白鉴定,用获取的蛋白裂解液包被ELISA 96孔板。收集天津医科大学总医院性病门诊沙眼衣原体感染者血清50份和未感染者血清30份,ELISA法检测血清中的相应特异性IgG抗体,将该结果与血清学微量免疫荧光检测和生殖道分泌物沙眼衣原体细胞培养两种传统金标准作比较[34]。结果：1.本研究完成了对pGEX-6p-2/Pgp3、pGEX-6P-2/CPAF、 pGEX-6P-2/CT143、pGEX-6P-2/CT101、pGEX-6P-2/CT694、pGEX-6P-2/CT875、 pGEX-6P-2/CT813、pGEX-6P-2/MOMP、pGEX-6P-2/IncA和pGEX-6P-2/HSP60 10种重组质粒及pGEX-6p-2空载体质粒的提取、鉴定和测序。2.本研究完成了GST-Pgp3、GST-CPAF、GST-CT143、GST-CT101、 GST-CT694、GST-CT875、GST-CT813、GST-MOMP、GST-IncA、GST-HSP60 10种融合蛋白及空质粒GST蛋白的表达、纯化和鉴定。3.50份C.t感染者血清中10种沙眼衣原体蛋白的抗体检出情况：Pgp3抗体88%(44/50)、CPAF抗体76%(38/50)、CT143抗体74%(37/50)、CT101抗体72%(36/50)、CT694抗体66%(33/50)、CT875抗体62%(31/50)、CT813抗体60%(30/50)、MOMP抗体52%(26/50)、IncA抗体48%(24/50)和HSP60抗体34%(17/50)；30份沙眼衣原体未感染者标本中10种沙眼衣原体蛋白的抗体检出情况：CT143抗体26.7%(8/30)、CT101抗体16.7%(5/30),其余8种抗体均未检出。4.50份沙眼衣原体感染者标本中,微量免疫荧光检测阳性44例,阴性6例；细胞培养阳性14例,阴性36例。30份沙眼衣原体未感染者标本中,微量免疫荧光检测结果与细胞培养检测结果均为阴性。5.沙眼衣原体Pgp3、CT694和CT875这3种免疫优势蛋白组合的血清学实验结果和微量免疫荧光、沙眼衣原体细胞培养的阳性符合率分别达到97.73%(43/44)和92.86%(13/14)。30份MIF检测阴性血清标本中未检出上述三种蛋白的抗体。结论：1. Pgp3、CPAF、CT143、CT101、CT694、CT875、CT813、MOMP、 IncA和HSP60 10种C.t免疫优势蛋白中,Pgp3抗原性最强,抗体检出率最高,其次是CPAF和CT143,所选的八种沙眼衣原体免疫优势蛋白中,除了IncA外,其余的7种蛋白的抗原性均强于MOMP和Hsp60。2.Pgp3、CT694和CT875这3种免疫优势蛋白组合对C.t的筛查敏感性最高,特异性最强。
【关键词】：衣原体 沙眼 免疫优势蛋白 血清学检测 微量免疫荧光
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R759
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 缩略语/符号说明11-13
• 前言13-16
• 研究现状、成果13-14
• 研究目的、方法14-16
• 一、沙眼衣原体免疫优势蛋白的表达16-35
• 1.1 对象和方法16-22
• 1.1.1 对象16-18
• 1.1.2 方法18-22
• 1.2 结果22-30
• 1.2.1 重组质粒转化22
• 1.2.2 重组质粒的提取22-23
• 1.2.3 重组质粒测序和blast比对23-28
• 1.2.4 融合蛋白表达及纯化28-30
• 1.3 讨论30-34
• 1.3.1 对沙眼衣原体候选蛋白的抗原性讨论30-33
• 1.3.2 GST Magbeads纯化、鉴定融合蛋白的讨论33-34
• 1.4 小结34-35
• 二、泌尿生殖道沙眼衣原体感染者血清抗体的检测35-44
• 2.1 对象和方法35-38
• 2.1.1 对象35-36
• 2.1.2 方法36-38
• 2.1.3 结果判断38
• 2.2 结果38-39
• 2.3 讨论39-42
• 2.3.1 血清处理方法的讨论39-40
• 2.3.2 谷胱甘肽包被的ELISA 96孔酶标板的使用40
• 2.3.3 重组沙眼衣原体蛋白的特异性抗体检出情况的讨论40-42
• 2.4 小结42-44
• 三、沙眼衣原体感染血清学筛查候选蛋白组合的优化44-52
• 3.1 对象和方法44-47
• 3.1.1 对象44
• 3.1.2 方法44-47
• 3.2 实验结果47-50
• 3.2.1 MIF法检测结果47-48
• 3.2.2 尿道/宫颈拭子沙眼衣原体细胞培养结果48
• 3.2.3 尿道/宫颈拭子PCR结果48-50
• 3.3 讨论50-51
• 3.3.1 传统金标准检测方法优缺点的讨论50
• 3.3.2 免疫蛋白组合的优化的讨论50-51
• 3.4 小结51-52
• 结论52-53
• 参考文献53-58
• 发表论文和参加科研情况说明58-59
• 综述59-68
• 综述参考文献64-68
• 致谢68

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前5条

1 陈晓旭,郭玲,伊纯德,杨学颖;国内对泌尿生殖道沙眼衣原体感染的研究概况[J];临床军医杂志;2001年01期

2 黄启强;顾艳;周晓兰;;3种方法检测286例生殖道沙眼衣原体的分析[J];检验医学与临床;2011年10期

3 陆春雪;吴移谋;彭波;李忠玉;胡四海;钟光明;;沙眼衣原体分泌性蛋白Pgp3滴鼻免疫增强小鼠对衣原体生殖道感染的保护作用[J];微生物学通报;2012年02期

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本文编号：805856