二甲双胍通过mTOR信号通路对Hacat角质形成细胞增殖的影响

发布时间：2017-09-21 05:03

  本文关键词：二甲双胍通过mTOR信号通路对Hacat角质形成细胞增殖的影响

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【摘要】：从20世纪50年代至今,二甲双胍已成为临床上治疗2型糖尿病的一线口服降糖药,它可以通过多种作用途径发挥降低血糖、改善胰岛素抵抗和代谢综合征的作用。2005年,英国科学家Evans发表的一项研究结果显示,二甲双胍能显著降低糖尿病患者的肿瘤风险和肿瘤患者的死亡风险。这篇文章发表以后,引起科学家的广泛兴趣,二甲双胍药理机制研究成为新的热点,临床适应症也随之不断扩大。近年来大量研究表明,二甲双胍与乳腺癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、结直肠癌、胰腺癌、白血病等多种肿瘤的发生、发展、侵袭及预后等密切相关,在多种恶性增生性疾病中,二甲双胍可以通过抑制细胞的生长增殖和免疫介导的炎症反应,减少肿瘤细胞侵袭性,降低肿瘤患者的死亡风险。在皮肤科领域,已有报道二甲双胍在部分多毛症、痤疮、化脓性汗腺炎、银屑病、皮肤肿瘤等方面发挥有益作用。二甲双胍能抑制黑素瘤细胞、皮肤鳞癌细胞的增殖,促进肿瘤细胞的凋亡,使动物移植肿瘤变小。另外,在对2008年一项36702例患者的大样本病例对照研究和2015年台湾的一项包括1659727患者的研究显示,二甲双胍除了对银屑病患者潜在的有益治疗作用以外,长期接受二甲双胍治疗的糖尿病患者的银屑病患病危险率显著下降。二甲双胍的生物学作用机制主要是通过组织细胞中最重要的能量代谢调节通路AMPK (Adenosine 5'-monophosphate (AMP)-activated protein kinase)信号转导通路实现。二甲双胍激活AMPK后,通过抑制下游的信号关键性分子mTOR (mammalian target of rapamycin)协同相关因子来调节细胞周期、细胞凋亡以及蛋白质合成,最终影响细胞的增殖。mTOR信号通路被认为是调控细胞增殖、分化的关键信号通路,它主要通过促进调节细胞生长的关键代谢过程,对营养水平、能量、各种生长因子以及环境因素等产生应答,参与调节细胞的不同生理活动,影响细胞的生长、增殖及凋亡,从而在多种肿瘤的发病、进展及预后中发挥重要作用。值得强调的是,在AMPK信号没有激活的情况下,二甲双胍也可以直接或通过其它多种途径抑制mTOR信号通路从而发挥其生物学效应。mTOR信号通路异常也参与多种皮肤疾病的发生发展,包括黑色素瘤,皮肤鳞状细胞癌等恶性皮肤肿瘤及痤疮、银屑病等良性炎症性皮肤疾病。研究显示在寻常型银屑病皮损中mTOR在表皮全层高表达,特别在基底层表达明显增高；mTOR信号通路下游的一个关键性因子-核糖体蛋白S6(SK6)在基底层以上的角质细胞中也呈激活状态。此外,mTOR信号通路可能通过介导表皮增生、调节免疫反应、血管生成等在银屑病的病理生理中发挥作用。目前已有多种靶向抑制mmTOR信号通路的药物在研发及临床试验阶段,已经展示出良好的抗肿瘤效果。然而,二甲双胍与mTOR信号通路对人角质形成细胞良性增殖的影响目前尚无相关基础研究。本课题通过体外细胞实验,检测二甲双胍对Hacat角质形成细胞增殖、凋亡的作用及其对Hacat细胞分泌促炎症因子的影响,并通过分子生物学的方法对其涉及的信号转导途径进行初步研究,从而探讨二甲双胍作为一种抗角质形成细胞增殖药物应用于临床治疗银屑病的可行性。第一部分二甲双胍对Hacat细胞体外增殖和凋亡的影响目的：观察二甲双胍干预后实验组及对照组细胞的形态学变化,并运用MTT(甲基噻唑基四唑)和流式细胞检测方法,探讨二甲双胍对Hacat细胞生长、增殖及凋亡的影响。方法：实验分为实验组、空白对照组(不加任何药物)。Hacat细胞分别以1x104/孔的密度在接种在96孔板中,37℃在5%CO2孵箱中培养过夜。(1)以25、50、100mmol/L三种浓度的二甲双胍分别对体外培养的Hacat细胞进行干预,在干预后第0、24、48、72和96h,MTT法检测各组细胞的增殖情况。(2)以25、50、100mmol/L不同浓度二甲双胍作用于Hacat细胞48h后,用不含EDTA的0.25%胰酶消化Hacat细胞并收集于流式管,Annexin V-FITC标记,应用流式细胞检测各组细胞的凋亡状况。结果：(1)贴壁生长的Hacat细胞中加入不同浓度的二甲双胍,在倒置显微镜下观察各组细胞,发现随着药物浓度增加和作用时间的延长,细胞的形态学发生明显的变化,细胞变圆变小,核固缩、碎裂,脱落漂浮细胞增多,细胞凋亡增加。(2)根据MTT测定的A490值而绘制细胞生长曲线,结果显示与对照组相比,随着作用浓度及作用时间的延长,二甲双胍能有效抑制Hacat田胞的生长,其中以50mmol/L以上浓度时抑制作用更为明显。以药物作用时间为横轴,细胞OD490值为纵轴,绘制细胞生长曲线,可以发现随着二甲双胍作用于Hacat细胞时间的延长,细胞的生长能力有明显下降。与对照组相比,不同浓度二甲双胍均能抑制Hacat细胞生长,25mmol/L二甲双胍作用48h后细胞呈明显生长抑制(P0.05),50mmol/L组和100mmol/L二甲双胍干预细胞24h后,细胞的增殖活性即显著下降(P0.05),100mmol/L组下降更为明显(P0.01)；计算细胞的存活率,结果显示随着作用时间的延长,存活细胞逐渐减少,50mmol/L的二甲双胍作用于细胞24、48、72和961时,细胞的存活率分别为75.6%、59.4%、40.7%和30.3%。(3)不同浓度二甲双胍作用于Hacat细胞48h后,与对照组相比,各组的细胞的早期凋亡率和晚期凋亡率均有所增加,其中50mmol/L组细胞的凋亡率比对照组增加(P0.05),早期凋亡细胞多于晚期凋亡细胞。100mmol/L组细胞的早期凋亡率和晚期凋亡率均显著增高(均P0.01),大部分细胞凋亡,晚期凋亡率更加明显。结论：二甲双胍能有效抑制体外培养Hacat细胞的生长、增殖,并诱导细胞早期凋亡和晚期凋亡,这种细胞生长抑制作用呈浓度及时间依赖性增强。第二部分二甲双胍对HaCaT细胞分泌促炎症因子的影响目的：应用ELISA方法检测不同浓度二甲双胍对HaCaT细胞分泌促炎症因子IL-6, TNF-α和VEGF表达水平的影响,以探讨二甲双胍对角质形成细胞炎症反应的影响。方法：对数生长期的Hacat细胞以2×105/孔密度接种于6孔板中培养过夜,细胞贴壁后用不含血清的DMEM同步化24h,以25、50、100mmol/L浓度的二甲双胍分别对细胞进行干预48h,提取细胞上清液,应用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测细胞上清液中促炎症因子IL-6, TNF-α和VEGF蛋白表达水平,450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。结果：不同浓度的二甲双胍作用于Hacat细胞48h均能抑制细胞分泌IL-6,TNF-α和VEGF的表达水平,随着二甲双胍浓度的增加抑制作用更加明显。25mmol/L浓度的二甲双胍即对IL-6有明显抑制作用(P0.05),50mmol/L和100mmol/L的二甲双胍对IL-6抑制作用更加显著(P0.01),50mmol/L的二甲双胍TNF-α和VEGF蛋白均有明显抑制作用(P0.05),100mmol/L的二甲双胍对VEGF有显著抑制作用(P0.01)。实验结果证明二甲双胍能抑制Hacat细胞分泌的多种促炎症因子,推测二甲双胍能减轻角质形成细胞的炎症反应,从而减轻炎症浸润和血管形成对角质形成细胞的促增殖作用。结论：本部分实验结果显示二甲双胍能抑制Hacat细胞分泌IL-6, TNF-α和VEGF的表达水平,并呈一定的浓度依赖性,进一步验证了二甲双胍的免疫调节作用。第三部分mTOR信号通路在二甲双胍抑制HacaT细胞增殖中的作用目的：研究二甲双胍对Hacat细胞内mTOR信号通路中关键分子mTOR和p70S6K的磷酸化蛋白及总蛋白表达水平的影响,探讨mTOR信号通路在二甲双胍对Hacat细胞生长抑制中的作用。方法：对数生长期的Hacat细胞接种在60mm培养瓶中,37℃在5%C02孵箱中培养过夜,细胞贴壁后用不含血清的DMEM同步化24h,以25、50、100mmol/L浓度的二甲双胍作用于细胞48h,分别抽提细胞总蛋白,BCA法测定蛋白浓度。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和转膜,考马斯亮蓝染色后,用TBST液(含5%脱脂奶粉)封闭非特异抗原,加入mTOR、p-mTOR (ser2448)、p70S6K、p-p70S6K一抗4℃孵育过夜,TBST洗涤3次后加入含辣根过氧化酶标记的山羊抗兔二抗反应1h,显色后化学发光系统采集图像。实验以β-actin作为内参照。结果：(1)不同浓度二甲双胍干预前后,Hacat细胞内mTOR和p70S6K的总蛋白表达强度无显著变化。但是二甲双胍能明显抑制细胞内p-mTOR和p-p70S6K蛋白水平,浓度为25、50、100mmol/L的二甲双胍作用于Hacat细胞48h, p-mTOR分别下降23.7%、49.0%和80.6%；p-p70S6K/分别下降30.2%、62.1%和81.2%,结果具有统计学意义。结论：二甲双胍能抑制Hacat细胞中mTOR和p70S6K蛋白的磷酸化,mTOR信号转导通路参与了二甲双胍对Hacat细胞增殖、凋亡和分泌促炎症因子的调控。
【关键词】：二甲双胍 Hacat细胞 mTOR信号通路
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R758.63
【目录】：

• 中文摘要5-9
• 英文摘要9-14
• 符号说明14-15
• 文献综述15-33
• 参考女献24-33
• 第一部分 二甲双胍对Hacat细胞体外增殖和凋亡的影响33-43
• 材料与方法33-36
• 结果36-37
• 讨论37-39
• 结论39
• 附图39-41
• 参考文献41-43
• 第二部分：二甲双胍对HaCaT细胞分泌炎症因子的影响43-52
• 材料与方法43-45
• 结果45
• 讨论45-48
• 结论48
• 附图48-49
• 参考文献49-52
• 第三部分 mTOR信号通路在二甲双胍抑制HaCaT细胞增殖中的作用52-62
• 材料与方法52-57
• 结果57-58
• 讨论58-60
• 结论60
• 附图60-61
• 参考文献61-62
• 小结62-63
• 致谢63-64
• 攻读学位期间发表的学术论文64-65
• 附件65-66
• English Paper66-83

【共引文献】

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本文编号：892509