缓激肽B1受体在慢性炎性皮损区痒感觉中的作用

发布时间：2017-09-21 23:01

  本文关键词：缓激肽B1受体在慢性炎性皮损区痒感觉中的作用

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【摘要】：研究背景及目的痒所描述的是一种引起机体产生抓挠欲望的不愉快感觉,其被认为是机体的一种自我防护反应。最近的研究表明：痒是一种独立于痛温触压觉之外的躯体感觉,同时,神经纤维与非神经纤维的细胞共同参与异常痒感觉的发生发展,这种观点逐渐受到人们的关注。皮肤作为机体最大感受器官,有密集的感觉神经纤维分布,是各种机体感受的初始阶段。特应性皮炎患者伴有难治性的瘙痒感觉,该症状与患者局部皮损区慢性炎性微环境息息相关。慢性全身性疾病如肾脏疾病、肝脏疾病、胆道疾病、恶性肿瘤或艾滋病等也常伴随慢性难治性瘙痒,该症状应用传统抗组胺药物治疗无效。慢性痒感觉与急性瘙痒感觉不同,搔抓行为不能减轻其瘙痒感受,反而可以诱发瘙痒感觉,从而形成“瘙痒-搔抓-瘙痒”恶性循环加重瘙痒感觉。课题组前期研究观察到在痛敏研究常用CFA模型中,局部皮损区应用致痛物质缓激肽诱发小鼠搔抓反应,且小鼠搔抓反应不能为应用吗啡所减弱,缓激肽B1受体参与此异常痒感觉的调节。同时,TRPV1抑制剂辣椒平对缓激肽在CFA炎性皮损区引起的异常痒感觉并没有明显影响,认为CFA炎性皮损区缓激肽引起瘙痒发生机制与其他机制所引起瘙痒不同。特应性皮炎患者血浆和组织激肽释放酶水平增加,这两种酶可使无活性的激肽原释放出活性激肽,包括缓激肽和胰激肽。缓激肽是肽类物质,不能透过细胞膜,需要与细胞膜上特异性受体结合才能发挥生物学作用。通常情况下,缓激肽对B2R具有激活作用,但必须通过羧肽酶作用水解为des-Arg(9)-bradykinin或者des-Arg(10)-kallidin才能激活B1受体。缓激肽是介导炎症反应重要的炎性肽,是目前已知的最强致痛物质及重要的炎症介导因子,同时也有研究认为其可参与多种生物活性物质的调节,或是直接激活或间接增敏TRPV1通道。缓激肽作用于激肽B1受体(kinin B1 Receptor, B1R)和激肽B2受体(kinin B2 Receptor, B2R),都是细胞型G蛋白偶联受体,B2R为组成性表达,激活后很快内化失活,B1R在正常生理状态下除在中枢神经系统组成性表达以外几乎不表达,而在白介素、细菌脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)、创伤、炎症等多种情况下诱导而快速产生,是一种可诱导性受体,能被持续激活而不失活。那缓激肽受体是否参与慢性炎性环境慢性自发性瘙痒感觉形成,其不同受体在该过程中的意义有待说明。我们选择关于慢性痒感觉研究常用的二苯基环丙烯酮(diphenylcyclopropenone DCP)引起的接触性皮炎模型,观察探究缓激肽受体在慢性炎性自发性瘙痒中的可能调节形式及机制。研究方法本研究均选用雄性SPF级C57BL/6J小鼠,鼠龄5～6周龄,体重20～25g,购置于广东省医学实验动物中心(中国,佛山)。实验动物的使用及处理方法均符合广东省医学科学院动物实验伦理委员会的要求,并严格按照规定减少动物痛苦,尽可能减少实验动物的使用数量。小鼠于实验前在七氟醚麻醉下颈背部皮肤剃毛,分别于第一天及第七天在颈背部剃毛区域局部涂抹1%DCP 0.1ml(或者溶剂丙酮对照组),之后进行行为学观察,观察前放置于透明塑料盒(22cm×12cm×10cm)内预适应30min,观察时间为30min,一只动物只做一次实验。首先对模型构建评价。成功建立小鼠颈背部慢性炎症自发性瘙痒模型后,根据预实验观察小鼠自发性瘙痒情况后选择DCP涂抹后第十天,将小鼠于实验前30min给予B1R拮抗剂/B2R拮抗剂/蛋白酶抑制剂。C57小鼠在行为学观察后,在七氟醚麻醉后取颈背部炎性皮损区(或者丙酮对照组)全层皮肤,蛋白表达量检测的部分离体后立即放入液氮中保存过夜再放入.80℃长期保存；mRNA表达水平检测的标本离体后采用以DEPC水去RNA酶处理后的组织,剪切至长度约3-5mm组织块,即用RNALater完全浸没后,4℃过夜,弃去RNALater后.80℃长期保存。之后用于检测Bdkrb1蛋白及mRNA表达水平。用于原位组织染色的标本在行为学观察后,在七氟醚麻醉后以4%多聚甲醛溶液进行心脏灌注,灌注成功约10分钟左右,取颈背部炎性皮损区(或者丙酮对照组)全层皮肤投入4%多聚甲醛中常温固定过夜。再取出皮肤标本进行脱水处理及石蜡包埋,切片,恒温箱中45℃拷片过夜或60℃ 2小时后行原位组织染色。为进一步研究B1R在角质形成细胞的功能,进行体外实验设计。培养稳定表达PAR1及PAR2受体的人HaCaT细胞株,观察PAR2受体激活B1R的表达变化,并对其可能机制进行探索。同时评价B1R对HaCaT细胞增殖与分化功能的影响。结果1.DCP炎性皮损区可引起自发性搔抓行为DCP局部涂抹能够建立稳定的皮肤接触性皮炎模型,包括出现皮肤红斑,继而产生毛囊增生等。本研究亦利用DCP这一特性在小鼠颈背部局部涂抹,使其产生慢性炎症及自发性搔抓。分别于第一天及第七天在两组小鼠颈背部局部涂抹DCP,小鼠颈背部二次局部涂抹DCP后,可在DCP涂抹后一天产生自发性搔抓行为,在二次涂抹后第一天(开始涂抹第8天)产生强而密集的自发性搔抓,到第十天达到高峰,30分钟内自发性搔抓次数达到168±53.48次,随后随着时间的推移递减。因此,为研究DCP模型自发性瘙痒的发生机制,我们均在DCP涂抹后第十天进行本研究其他各项实验。2.B1R参与DCP模型小鼠炎性皮损区自发性搔抓行为DCP应用后第十天的小鼠分别腹腔注射选择性B1R拮抗剂、B2R拮抗剂,剂量同本课题组CFA模型,或者激肽释放酶抑制剂,给药30min后持续观察小鼠的搔抓反应。与对照组相比,全身应用激肽释放酶抑制剂显著抑制DCP动物模型自发性瘙痒行为,9.83±11.92次(P=0.0208,图1.2,表1.2),10mg/kg的B1R拮抗剂全身用药可使小鼠30min内的搔抓次数从113.1±86.3 1减少至30.33±34.93次,而B2R抑制剂对该动物模型的自发性搔抓反应无明显影响。3.B1R在DCP模型局部皮损区表达增加在C57小鼠颈背部DCP炎性模型,小鼠的自发性搔抓行为及相关药物处理行为学数据显示B1R参与炎性皮损区自发性痒感觉发生过程,但B1R在炎性皮损区的表达量未定性定量评价,故应用分子生物学相关方法进一步研究B1R在炎性皮损区的表达量。检测DCP模型炎性皮损区皮肤组织B1R的mRNA及蛋白表达水平及组织原位表达情况。Western Blot、Q-PCR检测B1R表达水平可见B1R蛋白及mRNA水平表达上调,B1R蛋白免疫组织化学染色结果显示,B1R蛋白在DCP模型组小鼠皮肤组织中表达升高,强阳性信号主要分布于表皮基底层到棘细胞层及真皮的部分细胞。4.DCP模型小鼠皮损组织,B1R主要表达于角质形成细胞,而非末梢神经纤维。已有实验证据表明B1R在正常神经系统固有表达,那在外周组织中,在感觉形成的初始阶段,B1R是否表达于神经末梢直接参与感觉形成仍不清楚。我们应用免疫荧光双染技术检测发现：B1R与PGP9.5不具有明显共定位信号。5.激活人永生化角质形成细胞HaCaT细胞株PAR2受体,B1R的表达增加,可能机制是通过激活NF-κB通路动物模型结果提示B1R直接参与DCP慢性炎性模型中动物的搔抓行为,进一步定位分析提示B1R在小鼠皮肤上皮基底层到棘细胞层表达量较高。为进一步分析B1R在上皮分布的意义,根据组织定位分析中的结果提示,我们培养固定表达PAR1及PAR2受体的人HaCaT细胞株,PAR2受体激动剂(SLIGKV-NH2 100 μM)预处理HaCaT细胞24小时,B1R的基因转录及蛋白水平表达量均增加,具有统计学意义。之后,应用NF-κB通路抑制剂PDTC(25州)可显著减少PAR2受体激动剂预处理所致的B1R升高,具有统计学意义。提示PAR2受体激动剂可以通过NF-κB通路参与B1R的表达调控,进一步参与慢性炎症的发生发展。PAR2受体激动剂预处理HaCaT细胞,B1R拮抗剂(R892)并未影响上皮分化相关蛋白filaggrin的转录水平,同时对该细胞株的增殖功能也没有明显影响。在该细胞株中瞬时转染BDKRB1,同时使用B1R激动剂预处理也得到相同的结果,也即B1R激活不影响HaCaT细胞增殖与分化功能。结论1.B1R参与DCP模型小鼠炎性皮损区自发性搔抓行为；2.DCP模型小鼠局部皮损区,B1R表达增加；3.DCP模型小鼠局部皮损区,B1R主要表达于角质形成细胞,而非末梢神经纤维上；4.在人永生化角质形成细胞HaCaT细胞株,PAR2受体激动剂通过NF-κB通路参与B1R的表达调控,B1R激活不直接影响HaCaT细胞增殖与分化功能。
【关键词】：慢性瘙痒 缓激肽B1受体 角质形成细胞 HaCaT细胞株
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R758.31
【目录】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-14
• 前言14-21
• 第一章 缓激肽B1受体在DCP模型中的表达增加21-44
• 引言21-22
• 1 材料22-26
• 2 方法26-34
• 3 结果与分析34-40
• 4 讨论40-43
• 5 结论43-44
• 第二章 缓激肽B1受体在角质形成细胞的表达及意义44-55
• 引言44-45
• 1 材料45-46
• 2 方法46-49
• 3 结果与分析49-52
• 4 讨论52-54
• 5 结论54-55
• 全文结论55-56
• 参考文献56-68
• 英文缩略词索引68-70
• 在读期间发表的论文70-71
• 致谢71-72

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本文编号：897347