黑色素瘤细胞表达的LSECtin抑制抗肿瘤T细胞免疫反应并促进小鼠黑色素瘤的生长

发布时间：2017-09-22 19:15

  本文关键词：黑色素瘤细胞表达的LSECtin抑制抗肿瘤T细胞免疫反应并促进小鼠黑色素瘤的生长

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【摘要】：因为在黑色素瘤病人肿瘤组织内能发现大量的肿瘤浸润淋巴细胞，所以黑色素瘤相比较其他类型的肿瘤更具免疫原性。即便如此，针对于黑色素瘤的免疫疗法大多会失效，其主要原因是在这些黑色素瘤病人体内肿瘤抗原特异性的CD8+T细胞大多失去了应有的效应功能。目前有很多研究都致力于揭示导致这些肿瘤抗原特异性的CD8+T细胞失去其效应功能的内在机制。这些机制主要包括：肿瘤细胞破坏抗原提呈细胞的功能；下调抗原提呈细胞HLA分子的表达；上调肿瘤微环境中的抑制型因子，包括IL-6和IL-10等细胞因子；招募更多的抑制型细胞，例如调节性T细胞（regulatory T cells，Treg）和髓样起源的抑制型细胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSC）到肿瘤微环境中。近年来，T细胞免疫反应共抑制分子的功能和应用研究逐步受到重视。 肝脏和淋巴结窦内皮细胞粘附分子（Liver Sinusoidal Endothelial Cell Lectin，LSECtin）是我们实验室从肝脏中发现的II型跨膜C型凝集素受体，，前期研究表明其特异的表达在肝脏和淋巴结中的窦内皮细胞。其主要功能包括作为T细胞免疫反应的共抑制分子，在肝脏内抑制HBV病毒的清除，从而促进肝脏对HBV的耐受。从免疫学的角度看，抗肿瘤免疫反应和慢性病毒感染免疫反应有许多类似之处，因此，我们想知道LSECtin作为T细胞免疫反应的共抑制分子，是否抑制抗肿瘤免疫反应？ 首先通过检测包含有7种肿瘤组织RNA芯片中LSECtin的表达，来筛选其中高表达LSECtin的肿瘤类型，我们发现黑色素瘤病人中LSECtin表达量较高，且大约有30%左右的病人相对于正常人来说，其LSECtin表达量明显上调。接下来，我们进一步检测黑色素瘤病人组织RNA芯片中LSECtin的表达，在共计40例黑色素瘤病人组织中，有大约20例病人组织中LSECtin表达量相对于正常人的表达量明显上调。在RNA水平上确认了黑色素瘤病人组织中表达LSECtin之后，我们进一步从蛋白质水平，采用免疫组织化学法检测到黑色素瘤病人组织芯片中也表达LSECtin，同时采用流式分析法检测到黑色素瘤病人的术后新鲜黑色素瘤细胞表面也表达LSECtin。至此，我们确认黑色素瘤病人组织的确表达LSECtin。 国际上用于研究人黑色素瘤最好的动物模型是给C57BL/6小鼠接种B16细胞，因此我们需要检测B16细胞中LSECtin的表达情况。我们发现不论是RNA水平还是蛋白质水平，B16细胞中LSECtin的表达量都非常低，但是接种到小鼠体内的B16细胞在形成肿瘤之后，其LSECtin表达量明显上调，这也就提示我们很可能是肿瘤微环境会诱导B16细胞上调LSECtin的表达。通过获取小鼠黑色素瘤的组织提取物溶液模拟生理性的肿瘤微环境，我们发现其的确能够上调LSECtin的表达，并且通过相应的抗体封闭实验表明可能是肿瘤微环境中的IL-6和IL-10介导了这一上调。并且，外源的重组细胞因子IL-6和IL-10同样能够上调B16细胞LSECtin的表达。 在确认B16细胞本底表达LSECtin较低且在体内肿瘤微环境中会被诱导上调这一现象之后，我们构建了相应的B16细胞过表达LSECtin的稳定株B16-LSECtin及其对照稳定株B16-mock。首先，我们确认这两株细胞在体外的生长能力并无差异。接下来通过给野生型或者LSECtin敲除型的C57BL/6小鼠接种B16-LSECtin或者B16-mock细胞，我们发现无论是野生型还是LSECtin敲除型的小鼠，接种B16-LSECtin细胞之后，其生长速度明显快于接种B16-mock细胞的小鼠。为了确认这一现象是否依赖于LSECtin，我们给野生型或者LSECtin敲除型的C57BL/6小鼠接种B16细胞，再同时注射LSECtin的抗体，我们发现无论是野生型还是LSECtin敲除型的小鼠，接种B16细胞之后，如果注射了LSECtin的抗体，其肿瘤生长速度明显慢于注射对照抗体的小鼠。这些结果提示我们B16细胞表达的LSECtin会促进小鼠黑色素瘤的生长。 结合LSECtin的现有功能研究，我们猜想是否肿瘤细胞表达的LSECtin通过抑制T细胞抗肿瘤免疫反应来促进小鼠黑色素瘤自身的生长。为了检验这一假设，我们首先对接种B16-LSECtin或者B16-mock细胞的小鼠肿瘤组织进行免疫组织化学分析，发现二者肿瘤细胞的增殖情况和凋亡情况均无明显差异，这就提示我们二者肿瘤生长速度的差异与肿瘤细胞自身的生长情况无关，而可能与机体的T细胞抗肿瘤免疫反应有关。因此，我们采用CD4和CD8分子的抗体，来清除小鼠体内的CD4+或者CD8+T细胞，然后再分别接种B16-LSECtin或者B16-mock细胞，我们发现CD4+或者CD8+T细胞不存在的情况下，LSECtin过表达之后并不能使小鼠黑色素瘤的生长加快，这也就提示我们的确肿瘤细胞表达的LSECtin需要与T细胞相互作用来发挥其抑制功能，从而间接促进肿瘤自身的生长。 为了进一步明确肿瘤细胞表达的LSECtin是如何来抑制T细胞的抗肿瘤免疫反应，我们从两个方面着手：其一是否会影响T细胞的增殖，导致肿瘤内T细胞数目减少？其二是否会直接影响T细胞的效应功能？通过分离检测小鼠肿瘤浸润淋巴细胞中各种类型T细胞的比例，我们发现接种B16-LSECtin细胞的小鼠，其肿瘤浸润淋巴细胞中CD3+和CD8+T细胞的比例明显低于接种B16-mock细胞的小鼠。通过相应的体外共培养实验，也表明LSECtin能够抑制CD8+T细胞的增殖，但是不影响其凋亡。接下来，我们先给野生型C57BL/6小鼠接种B16-LSECtin和B16-mock细胞，再分离其肿瘤引流淋巴结细胞以及脾脏细胞，分别使用IFN-γ胞内细胞因子染色法（ICS）和酶联免疫斑点法（ELISPOT）检测这些细胞的效应功能。我们发现小鼠接种B16-LSECtin细胞之后，其肿瘤引流淋巴结细胞以及脾脏细胞的效应功能明显减弱。另一方面，我们采用体外共培养的实验体系，也表明肿瘤细胞表达的LSECtin能够抑制CD8+T细胞IFN-γ的释放。这些数据提示我们肿瘤细胞表达的LSECtin不仅可以抑制T细胞的增殖，导致肿瘤内T细胞数目减少，还能直接削弱肿瘤内T细胞的效应功能，从而整体上减弱机体的抗肿瘤免疫反应，促进自身生长。 在发现LSECtin的这一功能之后，我们想知道肿瘤细胞表达的LSECtin是与T细胞表达的什么分子进行相互作用，来介导这一功能呢？通过对免疫抑制型受体相关文献的挖掘并结合PRINCESS生物信息学工具的预测，我们获得了几个可能与LSECtin相互作用的分子，并通过表面离子共振法（SPR）筛选到其中LAG-3可以作为LSECtin相互作用蛋白的候选分子。接下来，我们分别从物理上的相互作用，包括免疫共沉淀法（Co-immunopreiciation，Co-IP）、酶联免疫吸附法（ELISA）以及细胞粘附实验确认了LAG-3能够与LSECtin发生物理上的相互作用。从功能上，通过使用LAG-3的封闭性抗体，我们发现将LAG-3封闭之后，不论是外源的重组LSECtin，还是肿瘤细胞表达的内源LSECtin，其对T细胞效应功能的抑制均得到一定程度的回复。这些数据提示我们肿瘤细胞表达的LSECtin很有可能是与T细胞表达的LAG-3发生相互作用，从而抑制T细胞的抗肿瘤免疫反应，从而间接促进肿瘤自身的生长。 综上所述，我们的研究结果显示：LSECtin是表达在黑色素瘤细胞表面的共抑制分子，抑制T细胞的抗肿瘤免疫反应，促进肿瘤的生长。LAG-3是表达在T细胞表面的共抑制分子，LSECtin可能与LAG-3相互作用抑制T细胞IFN-γ的分泌。LSECtin在黑色素瘤中的功能研究，揭示了机体对于黑色素瘤免疫耐受的一种新的分子机制。
【关键词】：LSECtin 黑色素瘤 免疫共抑制分子
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R739.5
【目录】：

• 缩略词表5-6
• 中文摘要6-9
• Abstract9-12
• 前言12-19
• 第一章 黑色素瘤组织和细胞表达 LSECtin19-32
• 第1节 黑色素瘤病人组织和细胞表达 LSECtin19-24
• 第2节 小鼠黑色素瘤细胞表达 LSECtin24-27
• 第3节 小鼠黑色素瘤细胞 B16 细胞中 LSECtin 表达的调控27-31
• 第4节 本章小结31-32
• 第二章 B16 细胞表达的 LSECtin 促进小鼠黑色素瘤的生长32-41
• 第1节 B16 细胞过表达 LSECtin 稳定株的构建及鉴定32-36
• 第2节 B16 细胞表达的 LSECtin 促进小鼠黑色素瘤的生长36-38
• 第3节 LSECtin 的抗体抑制小鼠黑色素瘤的生长38-40
• 第4节 本章小结40-41
• 第三章 B16 细胞表达 LSECtin 抑制抗肿瘤 T 细胞免疫反应41-58
• 第1节 LSECtin 不直接影响黑色素瘤细胞自身的生长41-43
• 第2节 LSECtin 促进黑色素瘤的生长依赖于 T 细胞43-46
• 第3节 LSECtin 抑制 CD~8+T 细胞的增殖46-52
• 第4节 LSECtin 在体内抑制 B16 特异性 CD~8+T 细胞的效应功能52-55
• 第5节 LSECtin 在体外抑制 CD~8+T 细胞的效应功能55-57
• 第6节 本章小结57-58
• 第四章 LSECtin 与 LAG-3 相互作用抑制 CD~8+T 细胞的效应功能58-70
• 第1节 生物信息学预测 LSECtin 的相互作用蛋白58-59
• 第2节 表面离子共振法筛选 LSECtin 的相互作用蛋白59-61
• 第3节 LAG-3 与 LSECtin 相互作用的验证61-65
• 第4节 LSECtin 与 LAG-3 相互作用抑制 T 细胞 IFN-γ的分泌65-69
• 第5节 本章小结69-70
• 讨论70-72
• 结论72-73
• 参考文献73-82
• 综述82-85
• 参考文献84-85
• 在学期间发表的与学位论文密切相关的代表性论著85-86
• 个人简历86-87
• 致谢87

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本文编号：902575