骨髓间充质干细胞通过激活自噬对大鼠脑出血后轴突及骨架蛋白的保护作用的研究

发布时间：2020-11-20 06:35

　　脑出血(Intracerebral hemorrhage,ICH)具有高发病率、死亡率和致残率,找到一种切实有效的治疗方式已经成为需要急迫解决的问题。骨髓间充质干细胞(Bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)作为干细胞的一种,在脑出血中的治疗作用近些年受到科学界的广泛关注,而其作用机制仍需要进一步探索。神经细胞骨架及轴突的状态在脑出血后的神经功能损伤和修复过程中起到了至关重要的作用,而亦有研究证明自噬能够调控神经细胞骨架及轴突的修复。因此,我们推测ICH后BMSCs治疗通过对自噬的调控参与了ICH后轴突和细胞骨架损伤和修复过程。本研究的开展可以为临床ICH后的针对性治疗提供思路和实验依据。目的:在大鼠脑出血后给予BMSCs治疗,观察血肿区神经纤维丝200(NF200)、微管相关蛋白-2(MAP-2)及自噬相关蛋白LC3的表达变化,并且通过进一步自噬抑制剂3-MA的干预,探索BMSCs和自噬在脑出血后的神经保护机制。方法:1将10只3周龄SD雄性鼠进行BMSCs分离、培养:采用体外贴壁法获取3周龄雄性大鼠骨髓细胞进行培养,观察细胞生长情况,并分离培养,应用流式细胞仪进行BMSCs表面标志物检测。2采用4组法将140只SD雌性大鼠进行随机分组:(1)Sham组(n=20),(2)ICH组(n=40)(3)ICH+BMSCs组(n=40)(4)ICH+BMSCs+3-MA组(n=40)。ICH、ICH+BMSCs、ICH+BMSCs+3-MA组采用立体定向仪造模,分别输入自体血100微升、1毫升3-MA和等剂量1×10~7个/毫升的BMSCs,Sham组不做处理。采用出血后1、3、5、7d做各组检测,检测:(1)血肿周围区HE染色;(2)含水量采用比重法,(3)免疫组织化学查看LC3定位;(4)Western-blot检测NF200、MAP-2、LC3的蛋白表达;(5)在检测认知方面,用另外40只鼠脑出血后7~10d做水迷宫实验。用软件SPSS21.0对所得统计结果进行分析。q检验进行两两比较,用ANOVA测定组间差异,统计学意义采用P0.05。结果:1.BMSCs培养与检测结果:传代培养约11~15d左右,细胞传至第3代,细胞逐渐融合,结构统一。流式细胞仪检测发现BMSCs表面标记物阳性率为:CD106为75.63%,CD29为76.47%,CD106和CD29呈阳性结果,CD45为5.39%,CD54为4.61%,CD45和CD54呈阴性表达。2.HE染色结果:Sham组大鼠脑组织形态完整,数量较多,胞核完整。ICH组脑出血后组织排列不紧密,明显水肿,毛细血管扩张,胞核缺损。ICH+BMSCs组与ICH组相比,血管间隙增宽,水肿减轻,细胞数量显著回升,有相对完整神经元形态。ICH+BMSCs+3-MA组与ICH+BMSCs组相比,形态、组织细胞数量方面不如其数量多,胞核也相对少见。3.水迷宫检测结果:与Sham组相比,ICH组大鼠需要更长的时间才能找到目标象限(P0.05)。和ICH组相比,在出血后7~10天ICH+BMSCs组大鼠找到目标平台所需时间更短(P0.05);相比于ICH+BMSCs组,在出血后7~10天ICH+BMSCs+3-MA组找到平台的时间延长(P0.05)。4.脑组织含水量:Sham组1、3、5、7d的含水量没有差别且含水量比较低。ICH组脑组织含水量从第1天开始增高,到第3天达到最高值,然后开始下降,而且在各时间点均比Sham组含水量高。ICH+BMSCs组的含水量与ICH组有相同的走势,在1~7d水平更低(P0.05)。和ICH+BMSCs组相比,ICH+BMSCs+3-MA组具有相似的变化趋势,且在1~7d含水量更高(P0.05)。5.MAP-2的蛋白印迹法检测结果:MAP-2在假手术组组间相近,表达较强。ICH组MAP-2的蛋白表达量在出血后1d开始下降(P0.05),在3d降到最低,然后开始回升,但是在伤后1~7d都低于Sham组(P0.05)。ICH+BMSCs组的MAP-2表达量和ICH组具有相同的变化趋势,然而每个时间点都比ICH组高,出血后1~7d差异更明显(P0.05)。相比于BMSCs组,ICH+BMSCs+3-MA组在各个时间点表达变化和前者相同,但其含量在各个时间点更低(P0.05)。6.NF200的蛋白印迹法检测结果:NF200在假手术组组间相近,表达较强。ICH组NF200在均明显的蛋白表达量在出血后1d开始下降(P0.05),在3d降到最低,然后开始回升,但是在伤后1~7d都低于Sham组(P0.05)。ICH+BMSCs组的NF200表达量和ICH组具有相同的变化趋势,然而每个时间点都比ICH组高,出血后1~7d差异更明显(P0.05)。相比于BMSCs组,ICH+BMSCs+3-MA组在各个时间点表达变化和前者相同,但其含量在各个时间点更低(P0.05)。7.LC3的蛋白印迹法检测结果:Sham组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ组间差别不大,较少阳性。和Sham组相比,各时间ICH组阳性程度上升,上升起始于第1天(P0.05),高峰出现于第3天(P0.05),全程阳性比Sham组高(P0.05)。ICH+BMSCs组与ICH组全程阳性程度更高,(P0.05)。ICH+BMSCs+3-MA组和ICH+BMSCs组相比,变化走向相同,在各个时间点而表达略低(P0.05)。8.LC3免疫组化检测结果:在血肿周围的皮质区检测LC3,Sham组中阳性细胞相对少见;ICH组与Sham组相比,第1天LC3细胞增多,高峰见于第3天;ICH+BMSCs组与ICH组变化相同,效果更强(P0.05);ICH+BMSCs+3-MA组比ICH+BMSCs组阳性减弱,变化趋势相似(P0.05)。结论:在大鼠脑出血后给予BMSCs治疗能够改善大鼠神经功能,其分子机制是通过激活自噬修复大鼠受损的神经元、轴突及骨架蛋白,进而发挥神经保护作用。
【学位单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R743.34
【部分图文】：

示意图,免疫组化检测,酒精,泪滴

(9) 95%酒精Ⅰ、Ⅱ中各 5min；100 %酒精Ⅰ、Ⅱ中各 10min；(10) 二甲苯Ⅰ、Ⅱ中透明各 10min，中性树胶封片，镜下观察。心脏灌注示意图2.8.3 免疫组化检测 LC3(1) 烤片：选取 4℃冰箱完整的脑组织切片置于烤箱中，60℃烤 1 h，烤至石蜡成泪滴状流下；(2) 石蜡切片常规脱蜡置水，PBS 冲洗 5 min×3 次；(3) 抗原热修复。把切片放于枸橼酸盐缓冲液中（0.1 mmol/L, p H6.0），微波炉修复高火（100℃）至沸腾，改为中火（60℃）继续加热 5min，自然冷却至室温（约 1 h）后，PBS 冲洗

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